阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7/Adm細(xì)胞系的建立及其耐藥特性

鄭婷婷，潘姝花，鄭旭升，吳登偉，許傳蓮

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)院，杭州310018）

阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7/Adm細(xì)胞系的建立及其耐藥特性

鄭婷婷，潘姝花，鄭旭升，吳登偉，許傳蓮

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)院，杭州310018）

建立腫瘤耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤細(xì)胞的重要手段之一，也是探討腫瘤多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)。采用大劑量間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，建立MCF-7/Adm耐藥模型；MTT法檢測(cè)耐藥倍數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞和MCF-7/Adm細(xì)胞中阿霉素的積累量；real-time PCR檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞存活的IC50值分別為0.535μg/mL和173.275μg/mL，耐藥倍數(shù)為324；MCF-7細(xì)胞中的阿霉素積累量較MCF-7/Adm明顯高；MCF-7/Adm細(xì)胞中mRNA水平ABCB1基因表達(dá)明顯上調(diào)，ABCG2和ABCC1基因表達(dá)下調(diào)。成功獲得對(duì)阿霉素耐藥的人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adm，為進(jìn)一步研究乳腺癌多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)提供有利工具，并且對(duì)乳腺癌化療藥物的篩選具有一定的意義。

阿霉素；乳腺癌；耐藥；ABCB1

0 引 言

乳腺癌是女性多發(fā)的惡性腫瘤之一，對(duì)婦女的身心健康造成嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)每年新增患者約200萬(wàn)人，死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］。目前，乳腺癌的治療中，化療占有十分重要的地位，尤其是對(duì)于癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散的患者，化療是主要的治療方法。然而隨著化療藥物使用時(shí)間的增長(zhǎng)，化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺死作用逐漸減小，同時(shí)也會(huì)表現(xiàn)出對(duì)不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的藥物產(chǎn)生交叉耐受性，這種現(xiàn)象稱為多要耐藥性（multidrug resistance，MDR）［3］。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥是化療成功的主要障礙，對(duì)腫瘤的治療極為不利，也是困擾著腫瘤學(xué)家和癌癥患者的一個(gè)重大問(wèn)題。MDR發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，但目前ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（the ATP-Binding Cassette Transporters）被認(rèn)為是導(dǎo)致MDR的主要機(jī)制之一，其在腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生中的主要作用是將化療藥物由腫瘤細(xì)胞內(nèi)泵至細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生［4］，其中與臨床腫瘤治療關(guān)系最密切的是ABCB1、ABCC1、ABCG2。建立耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤細(xì)胞的重要手段，對(duì)腫瘤的治療具有十分重要的意義，是探討惡性腫瘤多藥耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的基礎(chǔ)。本研究采用大劑量間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，建立阿霉素耐藥的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，并檢測(cè)耐藥模型較親本株的耐藥倍數(shù)，細(xì)胞內(nèi)藥物的積累量等參數(shù)，以及多藥耐藥的標(biāo)志基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的表達(dá)變化，為深入研究腫瘤耐藥及多藥耐藥逆轉(zhuǎn)提供理想的模型和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥物與主要試劑

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所，1640培養(yǎng)液購(gòu)于康寧公司，胎牛血清購(gòu)于Thermo公司，0.25%胰酶購(gòu)于碧云天公司，噻唑藍(lán)（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（Dimeth-yl sulfoxide，DMSO）購(gòu)于sigma公司，阿霉素（Adriamycin，ADR）購(gòu)于生工生物公司。

1.2 MCF-7細(xì)胞株的培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1 640培養(yǎng)液在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化，3～5 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 耐藥人乳腺癌細(xì)胞模型MCF-7/Adm的建立

采用大劑量間歇誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞［5］。①取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞按8×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加190μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為0.02、0.1、0.5、2.5、12.5μg/mL的阿霉素10μL/孔，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h；加入5 mg/mL的MTT 10μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入DMSO 150μL搖床上搖10 min，測(cè)定各孔的OD570值，計(jì)算阿霉素對(duì)MCF-7/細(xì)胞增殖的抑制率及IC50。其計(jì)算公式為：

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=［1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值）］× 100。

②取MCF-7細(xì)胞接種于6㎝培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入終濃度為0.6μg/mL（＞IC50）的阿霉素，作用12 h，棄含藥培養(yǎng)液換不含阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)代，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好以后，按上述方法重復(fù)，直至細(xì)胞能維持在0.6μg/mL阿霉素濃度下長(zhǎng)期培養(yǎng)即成為耐藥人乳腺癌細(xì)胞模型MCF-7/Adm。

1.4 MTT法檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞系的耐藥指數(shù)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，按每孔8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加190 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的ADR，其終濃度分別為0、1、5、25、125、250μg/mL，每孔總體積200μL；設(shè)對(duì)照孔為不加藥物的；調(diào)零孔為不加細(xì)胞的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，各孔加入MTT（5 mg/mL）10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)上清，每孔加入DMSO 150μL搖床上搖10 min，測(cè)定各孔OD570值，計(jì)算阿霉素對(duì)MCF-7/Adm細(xì)胞增殖的抑制率及IC50值、耐藥指數(shù)。其計(jì)算公式為：

耐藥指數(shù)（RI）=耐藥細(xì)胞IC50/野生型細(xì)胞IC50。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物的積累量

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞、MCF-7/Adm細(xì)胞，分別以1×105個(gè)細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，加RPMI 1 640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)液中加入阿霉素至終濃度為5μg/mL，培養(yǎng)24 h后，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，在重懸于冷PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，反射波長(zhǎng)575 nm）。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞、MCF-7/Adm細(xì)胞，分別以1×105個(gè)細(xì)胞接種于6㎝培養(yǎng)皿中，加RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞。Trizol法提取總RNA，檢測(cè)其濃度和純度。經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄分別得到其cDNA，用于Real-time PCR擴(kuò)增。引物如表1所示，PCR體系的總體積為20μL，其中包括dd H20 6.4μL，上下游引物分別0.8μL，已稀釋的cDNA2μL，SYRB 10μL，置于實(shí)時(shí)定量PCR儀設(shè)置反應(yīng)程序并進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)后收集熒光。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

表1 基因的引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)、方差分析，資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 大劑量間歇誘導(dǎo)出MCF-7/Adm細(xì)胞

通過(guò)終濃度為0.6μg/mL的阿霉素反復(fù)間歇誘導(dǎo)，歷時(shí)8個(gè)月成功誘導(dǎo)出MCF-7/Adm細(xì)胞。凍存復(fù)蘇后細(xì)胞仍能穩(wěn)定生長(zhǎng)、增殖。如圖1，與野生型MCF-7細(xì)胞比較，耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adm的形態(tài)發(fā)生明顯變化，邊緣不再呈尖角梭型，相對(duì)比較圓滑。野生型MCF-7細(xì)胞之間接觸比較緊密，而耐藥細(xì)胞株MCF-7/Adm之間間隙比較大，排列比較松散。在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞株MCF-7/ Adm消化時(shí)間較野生型稍長(zhǎng)。

圖1 MCF-7細(xì)胞及MCF-7/Adm細(xì)胞的形態(tài)觀察（×200）

2.2 ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞毒性作用及耐藥指數(shù)的檢測(cè)

不同濃度的ADM作用于MCF-7和MCF-7/ Adm細(xì)胞48 h后，如圖2所示，ADM對(duì)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞的抑制率都隨著ADM濃度的升高而增大，但ADM對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用明顯比MCF-7/Adm的強(qiáng)，0.02μg/mL的ADM已經(jīng)對(duì)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時(shí)，對(duì)MCF-7/Adm未見(jiàn)明顯抑制作用。與MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7/Adm細(xì)胞對(duì)ADM有明顯的耐藥性（表2），MCF-7/Adm細(xì)胞的耐藥指數(shù)RI為324倍（P＜0.01）。

圖2 阿霉素對(duì)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞增殖抑制作用（48 h）

表2 MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性

2.3 MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)阿霉素藥物蓄積量的測(cè)定

用終濃度為5μg/mL的ADM處理MCF-7細(xì)胞和MCF-7/Adm細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度，結(jié)果如圖3顯示MCF-7細(xì)胞內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度明顯比MCF-7/Adm高，分別為98.6%和51.4%。說(shuō)明MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)的阿霉素蓄積量明顯低于MCF-7細(xì)胞，進(jìn)一步說(shuō)明MCF-7/Adm細(xì)胞較MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性。

圖3 MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度

2.4 Real-time PCR檢測(cè)MCF-7/Adm細(xì)胞中多藥耐藥的標(biāo)志基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，與敏感細(xì)胞株MCF-7相比，MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)ABCG2、ABCB1和ABCC1基因的表達(dá)有明顯差異，如圖4，ABCG2和ABCC1在耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平下調(diào)，而ABCB1在耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)。

圖4 MCF-7和MCF-7/Adm細(xì)胞內(nèi)基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表達(dá)

3 討 論

目前腫瘤的多藥耐藥性仍被視為化療中的最大障礙。各種腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性的機(jī)制，都可能成為今后化療的靶點(diǎn)［6］。因此，深入研究腫瘤細(xì)胞耐藥性機(jī)制的產(chǎn)生，尋找關(guān)鍵的靶點(diǎn)，進(jìn)而針對(duì)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的藥物，為降低癌癥死亡率和提高治愈率增加希望［7］。

腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立是研究MDR發(fā)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)策略的重要手段。可以說(shuō)，目前已知的MDR機(jī)制幾乎都首先在耐藥細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，而后在臨床病人中得到證實(shí)的［8］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者們用藥物遞增誘導(dǎo)法建立了多種耐藥腫瘤細(xì)胞株，以深入研究腫瘤耐藥的機(jī)制。體外建立耐藥細(xì)胞株作為研究腫瘤細(xì)胞MDR機(jī)制的重要工具至今已有20多年的歷史，已產(chǎn)生多種誘導(dǎo)耐藥，建立耐藥細(xì)胞系的方法［5，8-9］。阿霉素（adriamycin，ADM）是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的抗腫瘤藥物，抗瘤譜較廣，主要適用于急性白血病，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等都有一定療效［10］。它是一種蒽環(huán)類抗生素，主要是通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞核固定在拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα-DNA復(fù)合體上，影響細(xì)胞增值，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有一定的殺傷作用［11］。研究表明，腫瘤化療過(guò)程中長(zhǎng)期使用阿霉素會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，而且已經(jīng)有很多阿霉素耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功的例子，所以本課題用阿霉素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7，建立可靠的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性模型。

本研究所采用的大劑量間歇誘導(dǎo)法與臨床周期性化療相似，更好地模擬臨床上化療患者出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象，它對(duì)腫瘤多藥耐藥性的研究更有意義。經(jīng)過(guò)此方法成功誘導(dǎo)得到MCF-7/Adm耐藥株，其耐藥指數(shù)為324。其細(xì)胞形態(tài)較野生型MCF-7細(xì)胞發(fā)生明顯變化，而且在培養(yǎng)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)耐藥株生長(zhǎng)也相對(duì)緩慢，胰酶消化時(shí)間也較野生型稍長(zhǎng)。MTT結(jié)果提示兩株細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性存在著顯著的差異（P＜0.01）。0.02μg/mL的ADM已經(jīng)對(duì)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時(shí)，對(duì)MCF-7/Adm未見(jiàn)明顯抑制作用，提示MCF-7/Adm細(xì)胞對(duì)ADM產(chǎn)生了顯著的耐藥性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示耐藥株內(nèi)阿霉素濃度明顯降低，這進(jìn)一步說(shuō)明耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功。Real-time PCR結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞內(nèi)ABCB1基因表達(dá)上調(diào)，而ABCC1基因和ABCG2基因表達(dá)下調(diào)。初步推斷其產(chǎn)生耐藥性與ABCB1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)，ABCB1導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥主要是將化療藥物由腫瘤細(xì)胞內(nèi)泵至細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生［12］。至于另外兩種耐藥相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)的原因尚不清楚，尚需進(jìn)一步研究。考慮到腫瘤多藥耐藥的分子機(jī)制非常復(fù)雜，是基因突變、相關(guān)蛋白的表達(dá)、各種酶介導(dǎo)、干細(xì)胞靶點(diǎn)表達(dá)缺失等多因素，多步驟綜合作用的結(jié)果［13］，需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究成功建立了一種人乳腺癌耐阿霉素的細(xì)胞株MCF-7/Adm，為進(jìn)一步研究乳腺癌多藥耐藥性的機(jī)制及耐藥性逆轉(zhuǎn)的藥物提供有利工具，并且對(duì)抗乳腺癌化療藥物的篩選具有重要的意義。

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EstabIishment of Adriamycin-Resistant Breast Cancer Mcf-7/Adm CeII Line and the Drug Resistance Feature

ZHENG Ting-ting，PAN Shu-hua，ZHENG Xu-sheng，WU Deng-wei，XUChuan-lian
（School of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Establishment of tumor drug-resistant cell lines is an important method to study tumor cells and is also the foundation of exploring tumor multidrug-resistant mechanism and the reverse.This paper adopted high-dose intermittent deduction method to induce MCF-7 cells and establish MCF-7/Adm drug-resistance model.MTT method is used to detect the drug-resistance times.Flow cytometry is used to detect the accumulation of adriamycin in MCF-7 cell and MCF-7/Adm cell.Real-time PCR was adopted to detect the genetic expression of ABCB1，ABCC1 and ABCG2 in MCF-7/Adm cell.The results show IC50values of MCF-7 and MCF-7/Adm cells restrained by adriamycin are 0.535 and 173.275μg/mL respectively，with drug-resistance times of 324；adriamycin accumulation in MCF-7 cells was significantly higher than that in MCF-7/Adm cells；genetic expression of ABCB1 in MCF-7/Adm cells at mRNA level up-regulated obviously；genetic expression of ABCC1 and ABCG2 down-regulated.This paper successfully gains adriamycin-resistant breast cancer drug-resistance cell strain MCF-7/Adm which provides a helpful tool for studying breast cancer multidrug resistance mechanism and the reverse.It is also significant to choose effective anti-caner drugs.

adriamycin；breast cancer；drug resistance；ABCB1

R737.9

A

（責(zé)任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）02-0216-05

2013-10-21

鄭婷婷（1987-）女，山西大同人，碩士研究生，主要從事抗腫瘤天然藥物方面的研究。