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    腦室內(nèi)注射胰島素改善心肺復(fù)蘇后大鼠神經(jīng)功能及其機(jī)制的研究*

    2014-05-24 07:13:50何婧瑜
    中國醫(yī)學(xué)裝備 2014年6期
    關(guān)鍵詞:海馬神經(jīng)元神經(jīng)功能

    何婧瑜 王 晶﹡

    ①首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院急診科 北京 100053

    我國每年約54.4萬患者需進(jìn)行心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)[1]。CPR后患者全腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷,神經(jīng)元凋亡顯著,神經(jīng)功能嚴(yán)重障礙,最終導(dǎo)致患者死亡或喪失生活能力,抑制神經(jīng)元凋亡成為當(dāng)前促進(jìn)腦復(fù)蘇的研究熱點[2-3]。胰島素是臨床常用的降糖激素,隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的進(jìn)展,胰島素抑制神經(jīng)元凋亡的作用逐漸被人們所了解。Duarte等[4]利用皮層神經(jīng)元I/R模型,發(fā)現(xiàn)胰島素可抑制促凋亡基因Caspase-3 mRNA的表達(dá),減少神經(jīng)元凋亡。目前,胰島素對于CPR后神經(jīng)系統(tǒng)凋亡的影響研究尚少,本試驗研究通過經(jīng)食道超速起搏誘發(fā)室顫,制備大鼠CPR模型,研究腦室內(nèi)注射胰島素通過調(diào)節(jié)Caspase-3 mRNA的表達(dá),抑制神經(jīng)元凋亡,改善神經(jīng)功能的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑

    0.1%鹽酸腎上腺素注射液(天津金縷氨基酸有限公司,批號為0508201);恩弗烷(河北九派制藥有限公司);In Situ Cell Death Detection Kit(POD:11 684 817 910);Real-time PCR引物(上海生工生物技術(shù)公司);PCR產(chǎn)物純化試劑盒(美國Qiagen);電子血糖儀(ACCU-CHEK Active)(德國羅氏);Opticon2 real time PCR and System(美國Transgenomic);PCR儀(美國Bio-RAD)。

    1.2 動物及分組

    30只健康成年雄性無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級SD大鼠,體重為330~360 g,由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動物實驗室提供。隨機(jī)分為:①假手術(shù)對照組(對照組6只);②心肺復(fù)蘇組(復(fù)蘇組12只);③心肺復(fù)蘇后胰島素干預(yù)組(胰島素組12只)。

    1.3 經(jīng)食道超速起搏誘發(fā)室顫建立大鼠心肺復(fù)蘇模型

    大鼠術(shù)前不禁食,經(jīng)口氣管插管以1%~2%恩弗烷聯(lián)合30%氧氣、70%笑氣混合吸入全麻。分離左側(cè)股動靜脈外接MP150生理記錄儀(美國BIOPAC),監(jiān)測動物血壓、心電圖及肛溫改變,維持體溫(37±0.5)℃。根據(jù)Jia等[5]和Song等[6]提供的方法,經(jīng)大鼠食管超速起搏心臟誘發(fā)室顫,6 min后CPR,經(jīng)股靜脈注射40 μg/kg腎上腺素;根據(jù)大鼠體重,由Harvard小動物呼吸機(jī)(美國MA1 55-7058)自動設(shè)定通氣頻率,潮氣量為6 ml/kg;人工手法行胸外心臟按壓,頻率為200次/min,按壓深度為大鼠胸廓前后徑1/3;持續(xù)3 min,未復(fù)蘇大鼠進(jìn)行5 J非同步電除顫;總復(fù)蘇時間>15 min剔除。大鼠恢復(fù)室上性心率,收縮壓>60 mm Hg并持續(xù)10 min以上,認(rèn)為復(fù)蘇成功。建模期間不使用其他藥物,復(fù)蘇過程中檢測各組大鼠血氣改變,確保胰島素組和復(fù)蘇組大鼠血氣無統(tǒng)計學(xué)差異,差異顯著予以剔出。

    1.4 給藥方式

    建模成功后10 min,大鼠分別置于立體定位儀下,于前囟后1.2 mm、左中線水平旁開1.5 mm及深3.5 mm處行腦室內(nèi)微量注射,胰島素組大鼠注射胰島素12.5 μl(1U)、其余組大鼠注射9%生理鹽水12.5 μl,注射過程緩慢,>10 min。

    1.5 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分(neurologic deficit scores,NDS)

    按照J(rèn)ia等[6]提供國際通用的NDS80分進(jìn)行評分,評價大鼠的神經(jīng)功能改變,0分代表腦死亡,80分代表大腦功能正常,分值越高其神經(jīng)功能越好。NDS>60作為大鼠神經(jīng)功能預(yù)后良好的獨立預(yù)測因子。復(fù)蘇前3 d評價大鼠神經(jīng)功能,剔出NDS最好或最差的大鼠,排除個體差異所造成的試驗誤差;自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation,ROSC)24 h、72 h和7 d后由受專業(yè)訓(xùn)練的兩個實驗員對各組SD大鼠采用雙盲法進(jìn)行獨立評分,最終NDS取兩者平均值。

    1.6 dUTP缺口末端標(biāo)記(dUTP nick end labeling,TUNEL)法染色

    CPR后7 d,將大鼠麻醉后灌注取腦,制備海馬石蠟切片。取視交叉以后由3 mm向后冠狀切開,每隔3張取1張切片,厚度為4 μm,連續(xù)取5張。采用末端脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的TUNEL法,嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行(原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒POD:11684817910)。在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài),凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核棕染,著色不均,染色質(zhì)向外周分散。400倍顯微鏡下計數(shù)每1 mm2高倍視野下凋亡細(xì)胞數(shù)目。5張切片凋亡細(xì)胞計數(shù)取平均值作為最終結(jié)果

    1.7 實時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)測定

    (1)引物設(shè)計。參照gen bank公布的引物序列進(jìn)行[7]。引物序列如下:Rat Caspase-3_F:5'-AACCTCCGTGGATTCAAAATC-3;Rat_Caspase-3_R:5'- TTCAAGAGTAATCCATTTTG TAAC-3(NM_012922)Rat_GAPDH_F:5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3';Rat_GAPDH R:5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'(NM_01008)。

    (2)RT-PCR檢測擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。大鼠斷頭取腦冰上剝離海馬,取海馬CA1區(qū)0.1 g組織Trizol法提取大鼠海馬總RNA;利用RT-PCR反應(yīng)檢測產(chǎn)物的分子量,保證產(chǎn)物的特異性。

    (3)熒光實時定量PCR半定量Caspase-3 mRNA的表達(dá)量(Opticon2實時定量PCR和系統(tǒng):美國Transgenomic)。在同一反應(yīng)中,用標(biāo)準(zhǔn)曲線校正不同實驗組大鼠海馬組織中GAPDH、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平,測得的值分別與該組的GAPDH比較得出每個細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的mRNA表達(dá)水平的相對定量。

    1.8 監(jiān)測心肺復(fù)蘇組及胰島素組血糖改變

    測定大鼠心肺復(fù)蘇前、復(fù)蘇時、復(fù)蘇后1 h、復(fù)蘇后2 h以及復(fù)蘇后24 h血糖。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

    統(tǒng)計結(jié)果由計算機(jī)統(tǒng)計包Spss 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(),組間比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料采用中位數(shù)(25 th~75 th百分位數(shù)),組間比較采用秩和檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性統(tǒng)計應(yīng)用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計。

    2 結(jié)果

    2.1 胰島素組與復(fù)蘇組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點促凋亡基因Caspase-3 mRNA表達(dá)量

    CPR后24 h和72 h,胰島素組促凋亡因子Caspase-3 mRNA表達(dá)量低于復(fù)蘇組,胰島素組及復(fù)蘇組Caspase-3 mRNA表達(dá)分別為:CPR后24 h(0.43±0.03,1.39±0.36,P<0.05);CPR后72 h(0.63±0.06,1.08±0.05,P<0.05);胰島素組72 h促凋亡因子Caspase-3 mRNA表達(dá)量高于24 h(0.43±0.03,0.63±0.06,P=0.006),復(fù)蘇組各時間點Caspase-3 mRNA表達(dá)量無差異(1.39±0.36,1.08±0.05,P>0.05)。

    2.2 各組大鼠CPR后7 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL染色的結(jié)果

    經(jīng)400倍顯微鏡放大觀察,胰島素組與復(fù)蘇組海馬與皮層散布棕色細(xì)胞,以海馬區(qū)最為密集(如圖1所示)。

    圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL染色情況

    在高倍視野下計數(shù)1 mm2陽性染色細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn),與對照組凋亡細(xì)胞(5.12±3.26/mm2)比較,復(fù)蘇組凋亡細(xì)胞(124.75±17.35/mm2)明顯增高,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=586.229,P<0.001);胰島素組凋亡細(xì)胞(92.79±7.5/mm2)低于復(fù)蘇組凋亡細(xì)胞(124.75±17.35/mm2)(F=5.853,P=0.02);但胰島素組凋亡細(xì)胞高于對照組凋亡細(xì)胞,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1685.336,P<0.001)。

    2.3 各組大鼠復(fù)蘇前、復(fù)蘇后24 h、72 h和7 d的NDS

    復(fù)蘇前各組大鼠無顯著的神經(jīng)功能缺陷;建模成功后對照組大鼠各時間點無功能缺陷。與對照組相比,復(fù)蘇組及胰島素組大鼠CPR后24 h和72 h神經(jīng)功能缺失顯著;CPR后7 d,NDS恢復(fù),其結(jié)果復(fù)蘇組與對照組相比24 h和72 h均為P<0.001;而7 d則P=0.395;胰島素組與對照組相比24 h和72 h均為P<0.001;而7 d則P=0.394。胰島素組與復(fù)蘇組比較CPR后24 h,胰島素組NDS高于復(fù)蘇組,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義;72 h評分胰島素組略高于復(fù)蘇組,但兩者比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.114);CPR后7 d胰島素組與復(fù)蘇組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.973)(見表1)。

    表1 各組大鼠不同時間NDS評分結(jié)果

    2.4 相關(guān)性檢測

    ①24 hNDS評分與24 hCaspsase-3 mRNA、72 h Caspase-3 mRNA表達(dá)量負(fù)相關(guān)(r=-0.961,P=0.002;r=-0.903,P=0.014)。

    ②24 h NDS,72 h NDS與7 d凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.893,P=0.03;r=-0.767,P=0.026)。

    2.5 腦室內(nèi)注射1U胰島素對于血糖的影響

    胰島素組與復(fù)蘇組CPR前、CPR時和CPR后1 h、2 h和24 h靜脈血糖值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CPR前胰島素組與復(fù)蘇組血糖(mmol/L)分別為44±1.61和6.32±0.74,P>0.05;CPR時血糖為0.06±2.31和9.24±2.66,P>0.05;CPR 1 h時血糖為8.46±3.16和7.78±3.28,P>0.05;CPR 2 h時血糖為5.10±1.82和6.3±3.84,P>0.05;CPR 24 h時血糖為6.40±2.27和7.40±1.17,P>0.05。

    3 討論

    CPR后腦缺血缺氧再灌注損傷,導(dǎo)致TFN-α,IL-6等大量釋放,與神經(jīng)元受體表面死亡受體Fas等結(jié)合,激活外源性凋亡通路如Caspases(半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶)級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致DNA斷裂,神經(jīng)元凋亡[8]。

    目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14種不同的Caspases,活化的Caspases參與許多細(xì)胞學(xué)凋亡特征的改變。正常神經(jīng)元中Caspase-3主要以惰性蛋白酶原Procaspase-3的形式存在于胞質(zhì)中,其分子量為32 kDa,僅存在微量表達(dá)的Caspase-3的活性亞基。Guan等[9]應(yīng)用大鼠血管夾閉全腦缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn),缺血、缺氧等傷害性刺激促使Caspase-3表達(dá)增高,胞質(zhì)內(nèi)無活性的Procaspase-3惰性蛋白酶原裂解為分子量12 kDa和17 kDa的Caspase-3活性亞基,通過多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性和外源性凋亡通路,促進(jìn)神經(jīng)元凋亡;全面抑制Caspases級聯(lián)反應(yīng)或僅抑制Caspase-3激活、表達(dá)均表現(xiàn)出抑制神經(jīng)元調(diào)亡的作用。Teschendorf等[10]利用6 min室顫法制備CPR模型證實,Caspase-3表達(dá)與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡顯著正相關(guān)。Caspases-3是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)器,是腦缺血過程中肯定的負(fù)面惡化因素[9-10]。

    本實驗研究發(fā)現(xiàn)對照組大鼠為排除體內(nèi)過剩及有害的細(xì)胞,維持正常的生理機(jī)能,僅小部分細(xì)胞自發(fā)性凋亡(如圖1A所示);6 min室顫后大鼠CPR全腦嚴(yán)重缺血再灌注損傷,其機(jī)體病態(tài)啟動神經(jīng)元凋亡程序,誘導(dǎo)大量神經(jīng)元凋亡,CPR后7d海馬及其對皮層神經(jīng)元凋亡顯著,以海馬區(qū)域最為密集(如圖1B、圖1C所示):CPR造成以凋亡為特點的嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷,以海馬最為嚴(yán)重[11]。CPR后10 min一次性腦室注射1 U胰島素,至少可以在7 d內(nèi)抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡(如圖1B所示)。

    探究胰島素抑制神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制,動態(tài)監(jiān)測胰島素對于外源性抑制凋亡因子Caspase-3表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn),復(fù)蘇組大鼠CPR后72 h Caspase-3 mRNA表達(dá)量略低于24 h,但兩者比較無統(tǒng)計學(xué)差異,表明CPR后24 h和72 h Caspase-3 mRNA在一定水平穩(wěn)定表達(dá)持續(xù)介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。CPR后24 h和72 h胰島素組Caspases-3 mRNA表達(dá)量顯著低于復(fù)蘇組,表明胰島素能夠抑制Caspases-3的表達(dá),影響外源性凋亡通路,抑制神經(jīng)元凋亡;胰島素組72 h Caspases-3定量高于24 h,表明胰島素可能延遲了Caspase-3產(chǎn)生高峰從另一側(cè)面發(fā)揮抗凋亡效應(yīng);同時表明,胰島素抗凋亡作用存在“劑量依賴效應(yīng)”,隨著時間的推移,腦室胰島素代謝增加,胰島素濃度水平降低,抑制凋亡的作用降低。由此推測,胰島素一次性干預(yù)不足以完全阻斷凋亡級聯(lián)放大反應(yīng)過程取得最好的療效,持續(xù)給予胰島素可能會收到更好的效果。

    應(yīng)用NDS評價胰島素對于CPR后神經(jīng)功能的影響發(fā)現(xiàn),胰島素能夠改善CPR后大鼠NDS;胰島素組神經(jīng)功能評分均>60,提示大鼠預(yù)后良好。結(jié)合NDS與Caspase-3 mRNA及凋亡細(xì)胞計數(shù)相關(guān)性分析,24 h NDS評分與24 h和72 h促凋亡因子Caspase-3表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān),與7 d凋亡細(xì)胞計數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān),而CPR后72 h其NDS與上述檢測指標(biāo)相關(guān)性降低,甚至不相關(guān),此現(xiàn)象表明:①CPR后24 h Caspase-3表達(dá)越高,高峰持續(xù)時間越長,神經(jīng)元凋亡越多,神經(jīng)評分越低,大鼠神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重[12];②胰島素通過抑制促凋亡因子的表達(dá),抑制神經(jīng)元凋亡,改善CPR后神經(jīng)功能障礙;③24 h NDS評分對于神經(jīng)元凋亡程度具有一定的預(yù)測價值;超出24 h其NDS與凋亡指標(biāo)的相關(guān)性降低,NDS對于凋亡的預(yù)測能力降低,因此需要探索其他方法預(yù)測凋亡。

    本試驗發(fā)現(xiàn),腦室內(nèi)注射胰島素對于外周血糖無影響,表明胰島素通過與中樞胰島素受體結(jié)合啟動特異的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[13]。獨立于降低應(yīng)激后血糖的作用發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用與Hui等[14]的試驗結(jié)果一致。

    綜上所述,本試驗從基因半定量、形態(tài)學(xué)及功能評分等多方面的研究表明,一次性腦室內(nèi)注射胰島素至少在7 d內(nèi)能夠調(diào)節(jié)CPR后抑凋亡因子Caspases-3的表達(dá),抑制神經(jīng)元凋亡,改善神經(jīng)功能評分,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。而胰島素如何通過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)Caspases-3的表達(dá)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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