條斑紫菜抗壞血酸過氧化酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳旸升等

摘 要：結(jié)合電子克隆及RT-PCR技術(shù)獲得條斑紫菜（Porphyrayezoensis）過氧化物酶基因。該基因cDNA序列長(zhǎng)847 bp，包含編碼245個(gè)氨基酸的開放閱讀框。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白無信號(hào)肽序列，與高等植物擬南芥的細(xì)胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶蛋白序列同源性較高，在細(xì)胞質(zhì)中行使功能。此外，該基因的進(jìn)化歷程基本符合植物從低等到高等的進(jìn)化過程。

關(guān)鍵詞：條斑紫菜；抗壞血酸過氧化物酶；克??；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S968.43+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.003

植物在干旱、高鹽、低溫、高溫等逆境中產(chǎn)生過量的活性氧基團(tuán)（Reactive oxygen species，ROS），細(xì)胞內(nèi)高濃度的ROS會(huì)引起細(xì)胞凋亡甚至壞死?？箟难徇^氧化酶（Ascorbate peroxidase，APX）是一類清除體內(nèi)過氧化氫的酶，對(duì)于植物和藻類不可缺少，它保護(hù)葉綠體及其他細(xì)胞器免受過氧化氫和由過氧化氫分解的羥基造成損傷。APX是植物抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一[1]。APX屬于多基因家族，由植物細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、過氧化物酶等細(xì)胞器中的多條同源基因組成[2]。大量研究表明，非生物脅迫條件下，植物以APX基因迅速表達(dá)、體內(nèi)抗壞血酸含量變化來響應(yīng)脅迫信號(hào)[3-6]。同時(shí)，大量APX基因過表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物均不同程度地提高了對(duì)氧化脅迫環(huán)境的抵抗能力[7-9]。

條斑紫菜（Porphyrayezoensis）屬于紅毛藻綱，由于它可以小規(guī)模培養(yǎng)，生長(zhǎng)周期短（實(shí)驗(yàn)室條件2～3月），基因組比較?。?60 Mbp），適合作為研究海藻生理學(xué)和分子生物學(xué)的模式生物而得到廣泛關(guān)注。目前，已經(jīng)可以得到條斑紫菜配子體和孢子體的大量EST序列。條斑紫菜生長(zhǎng)在潮間帶，長(zhǎng)期暴露于空氣，處于高鹽等惡劣環(huán)境中，這也使它成為研究藻類響應(yīng)非生物脅迫的優(yōu)良材料[10]。本研究克隆了條斑紫菜APX基因的cDNA序列，進(jìn)行了序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，為該基因在藻類中的作用機(jī)理和利用該基因進(jìn)行作物耐鹽轉(zhuǎn)基因改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜葉狀體采自大連旅順黃金山近海海域。Qiagen Rneasy Plant Mini試劑盒購自Qiagen公司，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、TAKARA LA Taq和dNTPs購自TAKARA公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，DEPC、乙醇等其他試劑均購自國內(nèi)外相關(guān)公司。

1.2 條斑紫菜葉狀體總RNA提取

取100 mg材料經(jīng)液氮研磨成粉末，用RNeasy Plant Mini試劑盒提取總RNA，按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書進(jìn)行，電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量和提取量，-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及基因克隆

在條斑紫菜EST數(shù)據(jù)庫中以ascorbate peroxidase為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，將得到的結(jié)果下載存盤，利用DNAman軟件進(jìn)行序列拼接，重疊序列拼接后用NCBI的ORF Finder在線預(yù)測(cè)開放閱讀框，推測(cè)其編碼的氨基酸序列。針對(duì)開放閱讀框設(shè)計(jì)一對(duì)引物：上游5`-CACCGCTGCCTGATCGTGCT-3`，下游5`-CAAACAACCAAGTGGCGGCTAC-3`，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度847 bp，包含APX基因完整ORF。

取總RNA2 μL，以O(shè)ligo（dT）為引物，用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒按說明書合成cDNA第一鏈。以合成的第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中10×LA PCR Buffer II （Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture （各2.5 mmol·L-1）8 μL，上、下游引物各1 μL，LA taq（5 U·μL-1）0.5 μL，模板2 μL，水32.5 μL。

PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。反應(yīng)后取5 μL產(chǎn)物電泳。將PCR產(chǎn)物送生工測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，用SIGNALp4.0分析信號(hào)肽。收集NCBI數(shù)據(jù)庫中的不同物種的APX序列，使用clustalW程序進(jìn)行多序列比對(duì)，保守結(jié)構(gòu)域分析利用prosite（http：//prosite.expasy.org/）和NCBI中的CDD預(yù)測(cè)工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后用MEGA5.1進(jìn)化分析樹構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜APX基因的克隆與序列測(cè)定

以ascorbate peroxidase為關(guān)鍵詞在條斑紫菜EST數(shù)據(jù)庫中檢索，得到AV43956、AV433118、AU189028、AU189855、AV433538等多條高度相似并彼此重疊的EST序列，拼接后得到一條1 041 bp的序列。PCR產(chǎn)物大小為847 bp（圖1、圖2），與預(yù)期大小相符，含有完整的ORF。

2.2 條斑紫菜APX基因的生物信息學(xué)分析

條斑紫菜APX基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)（圖3）。此蛋白具有高度保守的底物結(jié)合區(qū)域，屬于植物過氧化物酶超家族的一員。

擬南芥中的8種APX蛋白分布于不同的細(xì)胞器內(nèi)，成員之間同源性較低。選取這8種APX蛋白的氨基酸序列與條斑紫菜APX蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，條斑紫菜APX蛋白與擬南芥細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的APX蛋白（AtAPx01，AtAPx02）同源性最高，為51%～54%。該基因與其他幾條APX蛋白的氨基酸序列同源性較低，為12%～48%。信號(hào)肽分析結(jié)果顯示，此序列不含信號(hào)肽，所以這條APX基因可能為細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)APX。

將條斑紫菜APX編碼蛋白與擬南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麥（HvAPX）、小立碗蘚（PpAPX）、兩種溫泉紅藻（CcAPX，GaAPX）、萊茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白進(jìn)行同源分析，然后用MEGA軟件鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。從結(jié)果可以看出，雙子葉植物聚為一類，單子葉植物水稻、玉米、大麥，聚為一類。苔蘚植物小立碗蘚處在藻類與高等植物之間的過渡位置。條斑紫菜與兩種溫泉紅藻親緣關(guān)系較近。綠藻處于進(jìn)化樹的底部。其中紅藻和綠藻中的單細(xì)胞藻類分別處于各自分枝的底部。聚類結(jié)果與來源物種的系統(tǒng)發(fā)育模式一致。節(jié)點(diǎn)自展值較高，可以認(rèn)為得到的進(jìn)化樹結(jié)果可信。由此可見，抗壞血酸過氧化物酶基因的進(jìn)化歷程基本符合植物從低等到高等的進(jìn)化過程。

3 結(jié) 論

運(yùn)用電子克隆及RT-PCR技術(shù)得到條斑紫菜葉狀體抗壞血酸過氧化物酶基因的cDNA序列。該基因編碼蛋白無信號(hào)肽，其蛋白結(jié)構(gòu)域與高等植物相似，與其他藻類抗壞血酸過氧化物酶蛋白親緣關(guān)系接近，于細(xì)胞質(zhì)中行使功能。由于藻類中的相關(guān)報(bào)道較少，本研究為藻類中抗壞血酸相關(guān)生理生化過程的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.

將條斑紫菜APX編碼蛋白與擬南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麥（HvAPX）、小立碗蘚（PpAPX）、兩種溫泉紅藻（CcAPX，GaAPX）、萊茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白進(jìn)行同源分析，然后用MEGA軟件鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。從結(jié)果可以看出，雙子葉植物聚為一類，單子葉植物水稻、玉米、大麥，聚為一類。苔蘚植物小立碗蘚處在藻類與高等植物之間的過渡位置。條斑紫菜與兩種溫泉紅藻親緣關(guān)系較近。綠藻處于進(jìn)化樹的底部。其中紅藻和綠藻中的單細(xì)胞藻類分別處于各自分枝的底部。聚類結(jié)果與來源物種的系統(tǒng)發(fā)育模式一致。節(jié)點(diǎn)自展值較高，可以認(rèn)為得到的進(jìn)化樹結(jié)果可信。由此可見，抗壞血酸過氧化物酶基因的進(jìn)化歷程基本符合植物從低等到高等的進(jìn)化過程。

3 結(jié) 論

運(yùn)用電子克隆及RT-PCR技術(shù)得到條斑紫菜葉狀體抗壞血酸過氧化物酶基因的cDNA序列。該基因編碼蛋白無信號(hào)肽，其蛋白結(jié)構(gòu)域與高等植物相似，與其他藻類抗壞血酸過氧化物酶蛋白親緣關(guān)系接近，于細(xì)胞質(zhì)中行使功能。由于藻類中的相關(guān)報(bào)道較少，本研究為藻類中抗壞血酸相關(guān)生理生化過程的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.

將條斑紫菜APX編碼蛋白與擬南芥（AtAPX）、辣椒（CfAPX）、番茄（SlAPX）、棉花（GhAPX）、甜菜（BvAPX）、大豆（GmAPX）、水稻（OsAPX）、玉米（ZmAPX）、大麥（HvAPX）、小立碗蘚（PpAPX）、兩種溫泉紅藻（CcAPX，GaAPX）、萊茵衣藻（CrAPX）、小球藻（CvAPX）的蛋白進(jìn)行同源分析，然后用MEGA軟件鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。從結(jié)果可以看出，雙子葉植物聚為一類，單子葉植物水稻、玉米、大麥，聚為一類。苔蘚植物小立碗蘚處在藻類與高等植物之間的過渡位置。條斑紫菜與兩種溫泉紅藻親緣關(guān)系較近。綠藻處于進(jìn)化樹的底部。其中紅藻和綠藻中的單細(xì)胞藻類分別處于各自分枝的底部。聚類結(jié)果與來源物種的系統(tǒng)發(fā)育模式一致。節(jié)點(diǎn)自展值較高，可以認(rèn)為得到的進(jìn)化樹結(jié)果可信。由此可見，抗壞血酸過氧化物酶基因的進(jìn)化歷程基本符合植物從低等到高等的進(jìn)化過程。

3 結(jié) 論

運(yùn)用電子克隆及RT-PCR技術(shù)得到條斑紫菜葉狀體抗壞血酸過氧化物酶基因的cDNA序列。該基因編碼蛋白無信號(hào)肽，其蛋白結(jié)構(gòu)域與高等植物相似，與其他藻類抗壞血酸過氧化物酶蛋白親緣關(guān)系接近，于細(xì)胞質(zhì)中行使功能。由于藻類中的相關(guān)報(bào)道較少，本研究為藻類中抗壞血酸相關(guān)生理生化過程的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Shigeoka S. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J]. J Exp Bot， 2002， 53（372）： 1 305-1 319.

[2] Jimenez A. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves[J]. Plant Physiol， 1997， 114（1）：275-284.

[3] Hemavathi. Enhanced ascorbic acid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J]. Biotechnol Lett， 2010，32（2）： 321-330.

[4] Diaz-Vivancos P. Ectopic expression of cytosolic superoxide dismutase and ascorbate peroxidase leads to salt stress tolerance in transgenic plums[J]. Plant Biotechnol J， 2013， 11（8）：976-985.

[5] Zhang Z. Gene knockout study reveals that cytosolic ascorbate peroxidase 2（OsAPX2） plays a critical role in growth and reproduction in rice under drought， salt and cold stresses[J]. PLoS One， 2013，8（2）： 57 472.

[6] Li Z Q， Li J X， Zhang G F. Expression regulation of plant ascorbate peroxidase and its tolerance to abiotic stresses[J]. Yi Chuan， 2013，35（1）： 45-54.

[7] Danna C H. Thylakoid-bound ascorbate peroxidase mutant exhibits impaired electron transport and photosynthetic activity[J]. Plant Physiol， 2003，132（4）：2 116-2 125.

[8] Wang W， Vinocur B， Altman A. Plant responses to drought， salinity and extreme temperatures： towards genetic engineering for stress tolerance[J]. Planta， 2003，218（1）： 1-14.

[9] Gupta A S. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress （induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase-overexpressing plants）[J]. Plant Physiol， 1993，103（4）：1 067-1 073.

[10] Uji T. Molecular characterization and expression analysis of sodium pump genes in the marinered alga Porphyra yezoensis[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（8）： 7 973-7 980.