大豆脂肪氧合酶強(qiáng)化香菇風(fēng)味基料的風(fēng)味成分研究

張 嬋 ， 安晶晶 ， 王成濤 *， 文雁君

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；3.河南中大生物工程有限公司，河南 鄭州451162）

香菇口味鮮美，香味濃郁，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種高蛋白質(zhì)、低脂肪、多糖，含多種氨基酸及B族維生素。 香菇是世界第二大食用菌，也是我國(guó)特產(chǎn)之一。目前，香菇以鮮食為主，主要加工成品是罐頭食品和干制品，加工過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味損失嚴(yán)重[1-6]。

蘑菇的揮發(fā)性成分種類繁多，主要包括揮發(fā)性八碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯類等，1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、3-辛醇等揮發(fā)性八碳化合物是蘑菇最重要的風(fēng)味物質(zhì)。其中1-辛烯-3-醇（又名“蘑菇醇”）是蘑菇的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，具有青香、壤香、蠟香和未成熟的果香及牛奶風(fēng)味。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，蘑菇生長(zhǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)化生成1-辛烯-3-醇等八碳化合物的重要催化劑是脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX），菇體所含亞油酸等不飽和脂肪酸，在自身體系的脂肪氧合酶作用下，被氧化成氫過(guò)氧化物，氫過(guò)氧化物再經(jīng)過(guò)體系內(nèi)氫過(guò)氧化物裂解酶、氧化還原酶等作用產(chǎn)生1-辛烯-3-醇等，因此增加1-辛烯-3-醇等風(fēng)味化合物的來(lái)源，有利于提高風(fēng)味基料的組成。

LOX酶普遍存在于植物中，特別是大豆中提取的脂肪氧合酶活性明顯高于其它植物來(lái)源[7-9]，成熟大豆中LOX是活性最高的酶，大豆種子中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%左右，其中LOX質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%?？ㄗ延椭匈|(zhì)量分?jǐn)?shù)90%是不飽和脂肪酸，其中亞油酸占66%左右。為提高香菇風(fēng)味基料主風(fēng)味成分的含量，作者擬在香菇均漿液中添加葵花籽油水解液，利用大豆LOX和香菇內(nèi)源酶系，研究添加大豆脂肪氧合酶和葵花籽油水解液對(duì)強(qiáng)化香菇風(fēng)味基料風(fēng)味成分效果的影響，優(yōu)化其工藝參數(shù)，為香菇調(diào)味品的開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇、大豆 北京永輝超市選購(gòu)；葵花籽油（福臨門）：中糧集團(tuán)產(chǎn)品；1，2-鄰二氯苯（色譜純）、吐溫20（分析純）、正戊烷（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、石油醚（60~90 ℃，分析純）、四硼酸鈉、無(wú)水Na2SO4（用前干燥處理）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；鄰二氯苯、亞油酸 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）：Alfa Aesar公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設(shè)備

多功能料理機(jī)：榮事達(dá)公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋：山東鄄城華魯電熱儀器有限公司產(chǎn)品；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：金壇市至翔科教儀器廠產(chǎn)品；UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司產(chǎn)品；pHS-3D精密pH計(jì)：上海三信公司產(chǎn)品；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；Trace ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 工藝流程

圖1為香菇風(fēng)味基料的工藝流程。

圖1 香菇風(fēng)味基料的強(qiáng)化工藝流程Fig.1 Technological process of the enhancement of Lentinus edodes flavor

1.4 大豆LOX的提取

利用水浸提法制備大豆LOX粗酶液[10]。大豆研磨成細(xì)粉，研磨溫度35℃，過(guò)60目篩，經(jīng)冰水預(yù)冷的石油醚多次充分浸提，冷風(fēng)干燥，得到脫脂豆粕。取10 g脫脂豆粕，加100 mL冰水（料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL）攪拌浸提 1 h。 4 ℃，6 000 r/min離心 30 min，上清液即為粗酶液，測(cè)定其約為172 U/mL。LOX粗酶液穩(wěn)定性較差，在4℃條件下活性可保持1周左右。

1.5 LOX酶活力的測(cè)定

底物制備：將0.25 mL Tween20分散于10 mL 0.2 mol/L pH 9.0硼酸鹽緩沖液，搖動(dòng)、逐滴加入0.27 mL亞油酸，充分混合，加入1.0 mL 1 mol/L NaOH溶液至澄清，調(diào)pH 9.0，緩沖液稀釋至500 mL作為底物液。

酶活力測(cè)定[10]：取0.5 mL粗酶液移入2 mL底物液中，混勻，25℃水浴3 min，加5 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，再加入5 mL蒸餾水，6 000 r/min離心5 min，上清液于234 nm測(cè)吸光度；空白樣為0.5 mL酶液中加5 mL無(wú)水乙醇、2 mL底物溶液，25℃恒溫3 min，再加入5 mL蒸餾水。

酶活力定義：25℃、pH 9.0，以亞油酸為底物的3 mL反應(yīng)體系，234 nm每分鐘增加0.001吸光度值定義為一個(gè)酶活力單位。

1.6 葵花籽油水解液的制備

稱取葵花籽油20 g置于500 mL皂化瓶中，加入250 mL 0.5 mol/L KOH-乙醇溶液，90℃水浴回流l h，皂化、冷卻，皂化液濃H2SO4酸化至pH 3.0，1 000 mL分液漏斗，并加入少量飽和NaCl靜置，上層油相即為葵花籽油水解液（混合脂肪酸）[11]。

1.7 風(fēng)味化合物的提取及濃縮

正戊烷為溶劑萃取香菇勻漿中風(fēng)味化合物。香菇勻漿溫度冷卻至室溫，加入20 mL正戊烷，5 000 r/min離心10 min，上清液加入NaCl除去蛋白，5 000 r/min離心5 min，加入適量經(jīng)新鮮干燥 （500℃，4 h）的無(wú)水 Na2SO4，5 000 r/min 離心 5 min，得上清提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃濃縮至體積為2 mL，N2吹去溶劑，濃縮至1 mL，GC-MS檢測(cè)分析。

1.8 香菇風(fēng)味成分的強(qiáng)化

稱取洗凈新鮮蘑菇，按質(zhì)量比1∶1加入pH緩沖液，0.4%（以香菇質(zhì)量計(jì)，下同）葵花籽油水解液和一定量大豆LOX粗酶液，搗碎勻漿，勻漿并轉(zhuǎn)移至1 L保溫裝置中，進(jìn)行風(fēng)味強(qiáng)化。研究pH、溫度、時(shí)間、通氧速率、攪拌速度、粗酶液添加量等因素條件對(duì)香菇風(fēng)味成分的產(chǎn)生的影響，優(yōu)化工藝條件。

1.9 香菇風(fēng)味成分檢測(cè)

以鄰二氯苯為內(nèi)標(biāo)，利用GC-MS檢測(cè)以1-辛烯-3-醇、3-辛酮、1-辛醇、2-辛烯-1-醇為代表的風(fēng)味化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

TR-50MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：35 ℃保持 5 min，10 ℃/min升至 85℃，保持1 min，4℃/min升至 200℃，保持 3 min，10 ℃/min升至 230 ℃，保持 1 min；載氣（He）流速 1.0 mL/min，壓力 2.4 kPa，進(jìn)樣量 1.0 μL；分流比25∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度220℃；質(zhì)量掃描范圍 m/z 45～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮香菇的風(fēng)味成分分析

經(jīng)SDE裝置抽提、GC-MS分析，鮮香菇中共分離鑒定出風(fēng)味化合物32種（總離子流圖見(jiàn)圖2），主要是含硫化合物、醇類、醛類、酯類、酮類、呋喃類、烴類等。其中，鮮香菇中八碳化合物占揮發(fā)成分的44.13%、含硫化合物為21.53%、酯類化合物為7.60%。

八碳化合物是鮮香菇主要風(fēng)味物質(zhì)。其中1-辛烯-3-醇 （占 23.07%）、1-辛醇 （2.30%）、3-辛醇（11.43%）、2-辛烯-1-醇 （2.29%）、2-乙基-1-己醇（1.84%）、5-甲基-3-庚醇（0.03%）、3-辛酮（3.17%）等，尤其以1-辛烯-3-醇對(duì)鮮香菇風(fēng)味的貢獻(xiàn)為最大。鮮香菇中八碳化合物占44.13%，而干香菇中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.28%，因?yàn)榘颂蓟衔飺]發(fā)性較強(qiáng)，穩(wěn)定性不高，干制過(guò)程中損失嚴(yán)重。

含硫化合物也是香菇的另一類重要風(fēng)味組分。鮮香菇中鑒定出13種含硫化合物，主要是硫醚、含硫雜環(huán)兩大類。主要包括：1，2，4-三硫雜環(huán)戊烷、1，3，5-三硫雜環(huán)己烷、1，2，4，5-四硫雜環(huán)戊烷、1，2，4，6-四硫雜環(huán)庚烷、1，2，3，5，6-五硫雜環(huán)庚烷、1，3，5，7，9-五硫雜環(huán)癸烷、3，5-二甲基-1，2，4-三硫雜環(huán)戊烷等，占揮發(fā)性成分的8.9%。其中，1，2，3，5，6-五 硫 雜 環(huán) 庚 烷 （ 俗 稱 “ 香 菇 精 ”，Lenthionine）被認(rèn)為是香菇最重要的風(fēng)味化合物，賦予了香菇特征風(fēng)味，在鮮香菇揮發(fā)性成分中約占0.47%，它在水溶液中閾值為0.27~0.53 mg/kg；1，2，4-三硫雜環(huán)戊烷是鮮香菇中含量最豐富的一種含硫化合物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2.24%，該化合物有強(qiáng)烈大蒜味，也是香菇的重要呈味物質(zhì)，通常能影響菇體的主體香味。上述含硫化合物主要是由前體物質(zhì)--香菇酸在谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶作用下產(chǎn)生二硫雜環(huán)丙烷中間體聚合而成的[12]；含硫化合物含量的差異也導(dǎo)致了干香菇風(fēng)味特征更加濃郁，而鮮香菇則風(fēng)味清淡。

在鮮香菇中檢測(cè)出較高含量的硫醚類，如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、甲基（甲硫基）甲基二硫醚、雙（1-（甲硫基）乙基）二硫醚、甲基戊基二硫醚等，占鮮香菇揮發(fā)性成分的16.65%。二甲基二硫醚和二甲基三硫醚具有洋蔥的氣味，它們是1，2，3，5，6-五硫雜環(huán)庚烷的裂解產(chǎn)物。

圖2 鮮香菇揮發(fā)性香氣成分GC-MS總離子流圖譜Fig.2 GC-MS Total ion chromatogram of volatile aroma components in extract of fresh Lentinus edodes

2.2 大豆LOX粗酶液促進(jìn)香菇風(fēng)味生成效果的初探

Wurzenberger報(bào)道，揮發(fā)性八碳化合物的前體主要是16~22碳的不飽和脂肪酸，尤以亞油酸、亞麻酸為主。不飽和脂肪酸在O2存在的條件下，經(jīng)菇類自身的脂肪氧合酶、氫過(guò)氧化物裂解酶的連續(xù)作用形成八碳化合物，這類化合物風(fēng)味閾值較低，因此提供了濃郁的蘑菇風(fēng)味。1-辛烯-3-醇又稱“蘑菇醇”，廣泛存在于各種類蘑菇中，呈現(xiàn)出略帶金屬味的蘑菇特征性風(fēng)味。1-辛烯-3-醇在鮮香菇中含量為23.07%，而在干香菇中僅為4.77%，導(dǎo)致了香菇干品與鮮品在風(fēng)味上明顯不同，未經(jīng)加工的鮮香菇具有特征的蘑菇泥土香味，而香菇干品的特征蘑菇風(fēng)味則較為淡薄。

根據(jù)上述鮮香菇風(fēng)味成分的分析結(jié)果，選取1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）、3-辛酮（3-octenone）、1-辛醇（1-octanol）、2-辛烯-1-醇（2-octen-1-ol）等作為香菇風(fēng)味基料提升效果的考察指標(biāo)，添加一定量的葵花籽油水解液，以增加不飽和脂肪酸的來(lái)源，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究。在溫度30℃、保溫時(shí)間30 min、通入氧氣、攪拌的條件下，處理（1）香菇打漿液；（2）香菇打漿液+0.4%葵花籽油混合脂肪酸；（3）香菇打漿液+0.4%葵花籽油混合脂肪酸+0.5%LOX粗酶液的效果，對(duì)比各條件下風(fēng)味化合物的生成量。表1結(jié)果顯示，處理（3）香菇打漿液+0.4%葵花籽油混合脂肪酸+0.5%LOX粗酶液的風(fēng)味化合物生成量顯著增加，香菇風(fēng)味顯著增強(qiáng)。

表1 大豆LOX對(duì)香菇風(fēng)味化合物的影響Table 1 Influence of soybean lipoxygenase on the formation of Lentinus edodes flavor （μg/hg）

2.3 因素條件對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化香菇基料風(fēng)味成分效果的影響

2.3.1 反應(yīng)體系的pH對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響 在溫度30℃、保溫時(shí)間30 min、攪拌速度為1 000 r/min、通氧速率50 mL/min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸條件下，研究pH 4.0~9.0體系中pH對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化風(fēng)味成分效果的影響。圖3結(jié)果表明，在體系pH 5.0時(shí)，香菇基料中1-辛烯-3-醇、3-辛酮、1-辛醇、2-辛烯-1-醇的生成量均達(dá)到最大，體系的pH過(guò)低或過(guò)高都將影響相關(guān)風(fēng)味酶的活力，從而影響風(fēng)味物質(zhì)的生成，因此LOX強(qiáng)化香菇風(fēng)味的最佳體系為pH 5.0。這與雙孢蘑菇+亞油酸為底物時(shí)，1-辛烯-3-醇生成的最佳pH 6.0～7.0明顯不同。

圖3 pH對(duì)香菇風(fēng)味化合物生成的影響Fig.3 Effect of pH on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.2 溫度對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響 在反應(yīng)體系pH 7.0、保溫時(shí)間30 min、攪拌速度為1 000 r/min、通氧速率50 mL/min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸條件下，20~60℃時(shí)，溫度對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響。溫度對(duì)酶促反應(yīng)有一定影響（圖4），在25~40℃范圍內(nèi)，各風(fēng)味化合物生成量基本保持相當(dāng)水平；溫度40℃時(shí)，產(chǎn)物中1-辛烯-3-醇、2-辛烯-1-醇、1-辛醇出現(xiàn)峰值；體系溫度≥30℃時(shí)，3-辛酮生成量明顯下降；溫度≥40℃，各風(fēng)味成分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其原因可能是隨著溫度的提高，上述風(fēng)味成分的揮發(fā)速度加快或產(chǎn)生分解變化。考慮較高的溫度容易導(dǎo)致風(fēng)味成分的流失，因此認(rèn)為40℃是酶促反應(yīng)強(qiáng)化風(fēng)味的適宜溫度。

2.3.3 保溫時(shí)間對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響 在體系pH 7.0、溫度30℃、攪拌速度為1 000 r/min、通氧速率50 mL/min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸條件下，考察60 min內(nèi)香菇風(fēng)味成分酶促變化。各風(fēng)味化合物生成量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加（圖 5），且于 40 min時(shí) 1-辛烯-3-醇、2-辛烯-1-醇、3-辛酮生成量均出現(xiàn)峰值，隨后各風(fēng)味化合物逐漸減少。說(shuō)明LOX催化的亞油酸氧化成氫過(guò)氧化物不穩(wěn)定，易變性，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，香菇中多酚氧化酶的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致香菇漿液發(fā)生褐變。因此認(rèn)為強(qiáng)化時(shí)間以40 min為宜。

圖4 溫度對(duì)香菇風(fēng)味化合物生成的影響Fig.4 Effect of temperature on the formation of Lentinus edodes flavor

圖5 保溫時(shí)間對(duì)香菇風(fēng)味化合物生成的影響Fig.5 Effect of incubation time on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.4 攪拌速度對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響 在體系pH 7.0、溫度 30℃、時(shí)間 30 min、通氧速率 50 mL/min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸條件下，研究攪拌速度對(duì)香菇風(fēng)味化合物生成量的影響。圖6攪拌速度250~1 500 r/min時(shí)風(fēng)味強(qiáng)化的效果，表明攪拌速度對(duì)各風(fēng)味化合物生成量的影響較小。

圖6 攪拌速度對(duì)香菇風(fēng)味化合物生成的影響Fig.6 Effect of stirring speed on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.5 通氧速率對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響 LOX酶促反應(yīng)生成八碳化合物是一個(gè)加氧過(guò)程，需要氧氣參與。在體系pH 7.0、溫度30℃、時(shí)間30 min、攪拌速度1 000 r/min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸的條件下，研究通氧速率對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響。圖7所示，在50~250 mL/min通氧速率范圍，通氧速率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著，這與Martini研究利用大豆LOX催化生成13-HPOD的結(jié)論基本一致，即50 mL/min較低氧氣水平對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化是足夠的。

圖7 通氧速率對(duì)香菇風(fēng)味化合物生成的影響Fig.7 Effect of oxygen rate on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.6 大豆LOX粗酶液添加量對(duì)酶促?gòu)?qiáng)化效果的影響 在體系pH 7.0、溫度30℃、保溫時(shí)間30 min、攪拌速度 1 000 r/min、通氧速率 50 mL/min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%葵花籽油混合脂肪酸條件下，考察粗酶液添加量為0.1%~0.9%時(shí)，各風(fēng)味化合物生成量與大豆LOX粗酶液添加量的相關(guān)性（圖8）。隨著LOX粗酶液添加量的增加，各風(fēng)味化合物的生成量均呈現(xiàn)不同程度的增加，蘑菇風(fēng)味強(qiáng)度增大，添加量達(dá)到0.5%時(shí)，各風(fēng)味成分的增加幅度趨緩，因此選擇大豆LOX粗酶液添加量為0.5%。

圖8 大豆LOX粗酶液用量對(duì)香菇風(fēng)味成分生成的影響Fig.8 Effect of the amount of LOX crude extract on the formation of Lentinus edodes flavor

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)SDE裝置抽提、GC-MS分析，鮮香菇中共分離鑒定出風(fēng)味化合物32種，主要是含硫化合物、醇類、醛類、酯類、酮類、呋喃類、烴類等，其中八碳化合物占鮮香菇總揮發(fā)成分的44.13%、含硫化合物為21.53%、酯類化合物為7.60%。八碳化合物中1-辛烯-3-醇、1-辛醇、3-辛酮、2-辛烯-1-醇等，1，2，3，5，6-五硫雜環(huán)庚烷、1，2，4-三硫雜環(huán)戊烷等是鮮香菇主要風(fēng)味物質(zhì)。體系的pH、溫度、攪拌速度、通氧速率等因素條件對(duì)大豆脂肪氧合酶強(qiáng)化香菇風(fēng)味基料風(fēng)味成分的產(chǎn)生有一定影響，試驗(yàn)確定酶促?gòu)?qiáng)化風(fēng)味條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%LOX酶粗酶液添加量、0.4%葵花籽油水解液、pH 5.0、溫度40℃、攪拌速度500 r/min、通氧速率 50 mL/min、保溫時(shí)間40 min。

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