油菜蜂花粉中核苷類成分的分離及鑒定

段元鋒， 吳盼盼， 徐德平

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

油菜（Brassica campestris L.）是十字花科蕓薹屬植物，原產(chǎn)中國，顏色深綠，幫如白菜，為中國大面積種植的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物。油菜蜂花粉 （Rape Bee Pollen）是蜜蜂采集油菜的花粉，再經(jīng)蜜蜂加工而成的花粉團狀物，蜜蜂在采集花粉的過程中加入了一些分泌物[1-4]。蜂花粉內(nèi)含有許多的生物活性物質(zhì)如酚類、類黃酮、脂類、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等，被人們認(rèn)為是天然的健康食品，因此有“濃縮的營養(yǎng)庫”之稱，具有抗氧化和清除自由基、抗衰老、提高免疫力等功效[5-7]。

油菜蜂花粉中功能性成分的研究已有大量文獻(xiàn)報道，但油菜蜂花粉中的核苷類物質(zhì)研究少見報道。核苷類成分是生物細(xì)胞維持生命的重要物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、改善腦細(xì)胞代謝以及調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)等多種生理活性，人們現(xiàn)已研究開發(fā)了多種核苷類產(chǎn)品[8-10]。黃蘭等人對油菜蜂花粉中一種化合物，通過TLC薄層色譜法、LC-Q-TOF測定與腺嘌呤標(biāo)品比對等輔助方法，確定化合物為腺嘌呤，并未直接分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析[11]。作者首次從油菜蜂花粉中直接分離出3種核苷類成分并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為油菜蜂花粉中核苷類物質(zhì)的活性及生理作用等各方面的研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉：購自青海門源蜂場；ODS柱填料：Nacalai Tosoh Inc產(chǎn)品；AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化學(xué)工廠產(chǎn)品；GF254硅膠板：山東煙臺芝罘化工廠產(chǎn)品；無水乙醇、甲醇、正丁醇、冰醋酸、硫酸、茴香醛、氯仿：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ8-20中藥粉碎機：江陰市靈杏藥化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CQ-005萃取罐：常州市特威電氣自動化系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；R-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；BS-100A自動部份收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；ZF-90暗箱式紫外透射儀：上海顧村電光儀器廠產(chǎn)品；Avance-500核磁共振儀 ：瑞士Bruker公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 油菜蜂花粉水溶性成分的提取 稱取油菜蜂花粉10 kg，粉碎后過40目篩，置于100 L萃取罐中，按1 g∶5 mL料液質(zhì)量體積比加入去離子水，60℃條件下攪拌提取3 h，過濾取濾液，渣在同樣條件下，重復(fù)提取一次，合并濾液，減壓濃縮成浸膏保存。

1.3.2 油菜蜂花粉水溶性成分的粗分離 取浸膏加適量去離子水超聲條件下溶解，上大孔樹脂AB-8 柱（10 cm×150 cm），流量 20 mL/min，依次用去離子水，體積分?jǐn)?shù)20%、95%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗出液500 mL/段，分步收集，合并體積分?jǐn)?shù)20%乙醇洗脫溶液，減壓濃縮至無乙醇，得體積分?jǐn)?shù)20%乙醇洗脫物。

1.3.3 乙醇洗脫物分離 將體積分?jǐn)?shù)20%乙醇洗脫物上MCI-GEL柱（5 cm×150 cm），分別用去離子水，體積分?jǐn)?shù)5%、15%、25%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，自動收集器15mL/管收集洗脫液，采用TLC薄層法檢測，根據(jù)Rf值將洗脫液粗分為A，B，C等3部分，各部分分別減壓濃縮保存。

1.3.4 純化 將3部分分別上ODS-B（3 cm×100 cm）色譜柱，用乙醇溶劑梯度洗脫，流量10 mL/min，自動收集器15mL/管收集洗脫液，TLC薄層法跟蹤檢測洗脫液，將Rf值和顯色反應(yīng)一致的洗脫液合并減壓濃縮，反復(fù)上 ODS-B（3 cm×100 cm）色譜柱，直至得 3個純化合物，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

1.3.5 純度鑒定 將色譜分離的純的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，通過薄層層析法（TLC）進(jìn)行純度鑒定。展開劑為正丁醇-水-冰醋酸（體積比 5∶4∶3）溶液，顯色劑為甲醇-冰醋酸-濃硫酸-茴香醛（體積比 17∶2∶1∶0.1）溶液。

1.3.6 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個化合物結(jié)構(gòu)鑒定 對得到的化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以氘代吡啶為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為 內(nèi) 標(biāo)物 ， 通 過1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR進(jìn)行分析。經(jīng)1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR等方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的純度

如圖1顯示，由TLC薄層檢測化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在薄層板上均為單一斑點，表明分離后得到的化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的純度已達(dá)到核磁分析的要求。

圖1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的薄層色譜圖Fig.1 Thin layer chromatographic spectrum of componentⅠ、Ⅱ、Ⅲ

2.2NMR分析

2.2.1 化合物Ⅰ 白色無定形粉末，可溶解于水、含水甲醇、乙醇中。從化合物Ⅰ的1H-NMR圖譜可見，δ10.65，7.94各有1個單峰H信號，這二個H應(yīng)為活潑H，6.46有1個單峰H2信號，表明這二個H是N上H，δ5.70有1個雙峰質(zhì)子信號，J值為6.0，可能為糖的端基H信號，其余H信號為糖上H信號，推測該化合物含有1個糖基。13C-NMR（125 MHz）中可見到 10 個碳信號（見表 1），δ 95~110 處未見到糖的端基碳信號，δ 61~87有5個碳信號，推測該化合物含有1個五碳糖，δ 86.4應(yīng)為與N相連的端基碳，經(jīng)與文獻(xiàn)相比較得出為核糖。δ 110~160處見到5個碳信號，135DEPT中可見只有1個CH信號，其余4個為季碳，參照文獻(xiàn)可得這5個碳信號與鳥嘌呤一致。通過以上分析和文獻(xiàn)比較，確定化合物Ⅰ為鳥嘌呤核苷。

2.2.2 化合物Ⅱ 白色無定形粉末，可溶解于水，含水甲醇、乙醇中。從化合物Ⅱ的1H-NMR圖譜可見，δ8.37，8.16各有1個單峰H信號，這二個H應(yīng)為活潑H，7.35有1個單峰H2信號，提示這二個H是N上H，δ5.90有1個雙峰質(zhì)子信號，J值為6.0，可能為糖的端基H信號，其余H信號為糖上H信號，推測該化合物含有1個糖基。13C-NMR（125 MHz）中可見到 10 個碳信號（見表 1），δ 95~110 處未見到糖的端基碳信號，δ 61~87有5個碳信號，推測該化合物含有1個五碳糖，δ 86.4應(yīng)為與N相連的端基碳，經(jīng)與文獻(xiàn)相比較得出為核糖。δ 110~160處見到5個碳信號，135DEPT中可見只有2個CH信號，其余4個為季碳，參照文獻(xiàn)可得這5個碳信號與腺嘌呤一致。通過以上分析和文獻(xiàn)比較，確定化合物Ⅱ為腺嘌呤核苷。

2.2.3 化合物Ⅲ 白色無定形粉末，可溶解于水，含水甲醇和乙醇中。從化合物Ⅲ的1H-NMR圖譜可見，δ 13.22有1個單峰H信號，應(yīng)為活潑H；δ 5.11有1個雙峰質(zhì)子信號，J值為6.4，可能為糖的端基H信號，δ 1.95有一個單峰甲基，δ 5.11其余H信號為糖上H信號，推測該化合物含有1個糖基。13CNMR（125 MHz）（見表 1）中可見到 10 個碳信號，δ 95~110處未見到糖的端基碳信號，δ 89.0應(yīng)為與N相連的端基碳，δ 61~87有4個碳信號，δ 41.5有一個CH2信號，推測該化合物含有1個脫氧五碳糖，經(jīng)與文獻(xiàn)相比較得出為2-脫氧核糖。δ 110~160處見到4個碳信號，135DEPT中可見只有1個CH信號，其余3個為季碳，δ 12.9有一個甲基碳信號，參照文獻(xiàn)可得這5個碳信號與胞腺嘧啶一致。通過以上分析和文獻(xiàn)比較，確定化合物Ⅲ為胞腺嘧啶脫氧核苷。

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在13C-NMR中的碳信號Table 1 Signals of carbon in the13C-NMR of CompoundⅠ，Ⅱ andⅢ

3 結(jié)語

油菜蜂花粉的水提物，經(jīng)過AB-8柱粗分離，再經(jīng)MCI-GEL柱，ODS-B色譜柱分離純化，得到3種化合物，最后通過核磁共振分析，3種化合物分別為：鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、胞腺嘧啶脫氧核苷。3種化合物均為首次從油菜蜂花粉中直接分離純化并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的核苷類物質(zhì)，其中的鳥嘌呤核苷、胞腺嘧啶脫氧核苷在油菜蜂花粉中首次報道。

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