添加輔酶前體及流加誘導(dǎo)物提高黃嘌呤氧化酶發(fā)酵產(chǎn)率

張玉然， 楊海麟， 辛 瑜， 張 玲， 王 武

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

黃 嘌 呤 氧 化 酶 （xanthine oxidase，XOD，EC 1.17.3.2），為胞內(nèi)誘導(dǎo)酶，含鉬蝶呤、鐵硫簇及FAD輔因子?？蓪⒋吸S嘌呤氧化酶黃嘌呤，繼而氧化為尿酸，是嘌呤代謝的關(guān)建酶，與心血管疾病及系統(tǒng)先天免疫有關(guān)[1]。黃嘌呤氧化酶是一種重要的診斷用酶[2-3]，在食品工業(yè)中，亦可用于檢測肉類中嘌呤含量[4]。

國內(nèi)外關(guān)于黃嘌呤氧化的研究，主要集中于酶在各物種中的分布[5-6]、活力調(diào)節(jié)[7]、與疾病的關(guān)系[8-9]等。關(guān)于黃嘌呤氧化酶發(fā)酵的研究報道也多集中于菌種選育及搖瓶水平上的發(fā)酵條件優(yōu)化[10-11]。黃嘌呤氧化酶發(fā)酵的有效控制策略、合理流加發(fā)酵方法及產(chǎn)酶代謝等有待于研究。

當(dāng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量受某種組分濃度影響時，流加發(fā)酵法因可以解除底物的抑制、產(chǎn)物的反饋抑制等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用[12-13]。相對于分批發(fā)酵，流加發(fā)酵可以提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。黃嘌呤屬于胞內(nèi)誘導(dǎo)酶，過量加入誘導(dǎo)物將抑制菌體生長和產(chǎn)酶，而對其流加發(fā)酵的研究報道較少。

由京都基因與基因組百科全書（KEGG）報道的節(jié)桿菌嘌呤代謝圖知，嘌呤降解代謝需一系列酶系共同作用，黃嘌呤氧化酶參與前期次黃嘌呤、黃嘌呤的降解，后續(xù)酶系最終將尿酸降解為氨，中間代謝產(chǎn)物涉及尿酸、尿囊素、尿囊酸等。有關(guān)文獻(xiàn)報道，在Neurospora crassa嘌呤降解代謝中，某些代謝產(chǎn)物達(dá)到一定濃度時，將抑制嘌呤降解酶系中相關(guān)酶的繼續(xù)合成，進(jìn)而抑制嘌呤降解[14]。關(guān)于節(jié)桿菌嘌呤降解代謝產(chǎn)物與黃嘌呤氧化酶合成之間的關(guān)系研究報道極少。

作者對黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生菌進(jìn)行分子鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；添加輔酶前體（核黃素、硫胺素）不同程度提高了發(fā)酵產(chǎn)酶；在7.5 L發(fā)酵罐中，利用流加發(fā)酵方法，提高發(fā)酵液黃嘌呤氧化酶產(chǎn)率，并測定分批發(fā)酵過程中的代謝終產(chǎn)物銨根離子的變化，分析銨根離子與黃嘌呤氧化酶發(fā)酵的關(guān)系。研究提高黃嘌呤氧化酶發(fā)酵產(chǎn)率的方法，探索影響發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素，可為黃嘌呤氧化酶的進(jìn)一步發(fā)酵放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

菌種為作者所在實驗室保藏菌種，經(jīng)形態(tài)及生理生化初步鑒定為節(jié)桿菌屬，命名為ArthrobacterM3。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 （g/L）：氯化鈉 5.0，酵母抽提物2.4，三水磷酸氫二鉀 1.0，玉米漿 6.0 mL（pH 7.5）。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖 13.0，氯化鈉5.0，酵母抽提物 2.4，三水磷酸氫二鉀 0.8，玉米漿6.0 mL，無水氯化鈣 0.1，六水氯化鎂 0.2，七水硫酸亞鐵 1.0 mg，二水鉬酸鈉 15.0 μg，次黃嘌呤 3.0。

1.3 主要材料

細(xì)菌基因組DNA小量快速抽提試劑盒：北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；黃嘌呤、次黃嘌呤：上海雙向西巴斯科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶：上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；酵母粉：英國Oxford公司產(chǎn)品；玉米漿：山東菱花味精股份有限公司產(chǎn)品；其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 主要儀器

7.5 L 發(fā)酵罐（BioFlo 115）：美國 New Brunswick Scientific公司產(chǎn)品；V1100D可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：金壇市城東科輝儀器廠產(chǎn)品；pH計（PB-10型）：德國賽多利斯股份有限公司產(chǎn)品；HYL-A雙層全溫?fù)u瓶柜：太倉市強(qiáng)樂實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LaChrom C18-AQ反相色譜柱及日立高效液相色譜儀：日立高新技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.5 培養(yǎng)方法

1.5.1 種子培養(yǎng) 從固體斜面培養(yǎng)基中，挑取3環(huán)菌泥接入30 mL種子培養(yǎng)基 （250 mL三角瓶），30℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。

1.5.2 發(fā)酵培養(yǎng) 搖瓶培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為120 mL/L，30 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng) 18 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：7.5 L全自動發(fā)酵罐中裝液量共3.2 L（接種量3%），攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，通氣量1.0 L/（L·min），30 ℃。 前期不控制 pH（初始 pH 8.6），待菌體密度約2.0 g/L時，采用2.0 mol/L氫氧化鈉和2.0 mol/L鹽酸控制發(fā)酵液pH恒定7.6。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體量測定 采用比色法（λ=600 nm）和細(xì)胞干重法，取一定量發(fā)酵液于8 000 g下離心10 min，菌泥于105℃烘至恒重，稱重，計算菌體濃度。1.6.2 誘導(dǎo)物濃度測定 采用日立LaChrom C18-AQ （4.6 mm×250 mm，5 μm）反相柱進(jìn)行測定。 測定條件：流動相V（磷酸二氫鉀緩沖液，20 mmol/L，pH 7.5）∶V （乙腈）=95∶5， 流量 0.4 mL/min， 進(jìn)樣量 20 μL，檢測波長254 nm。

1.6.3 銨根離子濃度測定 采用苯酚-次氯酸方法[15]，向 2 mL A 液（10 g/L苯酚，0.029 g/L亞硝基鐵氰化鈉）中加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的發(fā)酵液樣品100 μL，混勻，加入2 mL B液（6 g/L氫氧化鈉，6 mL/L次氯酸鈉），37℃水浴反應(yīng)20 min，于550 nm下測定吸光值。

1.6.4 XOD酶活測定 黃嘌呤氧化酶測定方法詳見參考文獻(xiàn)[16]。酶活力單位定義：在37℃下，每分鐘形成1 μmol過氧化氫所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

定義：黃嘌呤氧化酶產(chǎn)率即為菌體破壁后測得的對應(yīng)發(fā)酵酶活（U/L）；平均產(chǎn)率系數(shù)即為發(fā)酵t小時單位菌體產(chǎn)酶量（U/g）。

1.7 菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

以提取的Arthrobacter M3總DNA為模板，通用引物27F和1492R為引物，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR程序設(shè)定：94℃預(yù)變性5 min；94℃45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s， 循環(huán)擴(kuò)增 30 次，72 ℃延伸10 min。電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物通過上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果提交至NCBI，進(jìn)行BLAST同源序列搜索比對，利用CLUSTAL X 2.0及MEGA 4.0軟件進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 流加發(fā)酵方式

補(bǔ)料方式1：補(bǔ)料1次，添加4.0 g/L葡萄糖、補(bǔ)次黃嘌呤質(zhì)量濃度至3.6 g/L。

補(bǔ)料方式2：分批補(bǔ)料3次，每次添加4.0 g/L葡萄糖及補(bǔ)次黃嘌呤質(zhì)量濃度至3.6 g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，割膠測序得到16S rDNA序列，通過NCBI進(jìn)行同源比較，結(jié)果顯示同源性較高的菌為Arthrobacter sp.，同源性均為99%，這與前期經(jīng)形態(tài)及生理生化初步鑒定結(jié)果一致。采用CLUSTAL X 2.0及MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，與此Arthrobacter M3菌株同源性較高的菌株為Arthrobacter globiformis strain DSM 20124，因此進(jìn)一步鑒定菌株Arthrobacter M3為球形節(jié)桿菌（Arthrobacter globiformis）。

圖1 基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S ribosomal DNA sequences of M3

2.2 誘導(dǎo)物濃度對XOD分批發(fā)酵的影響

經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶為誘導(dǎo)型酶，最佳誘導(dǎo)物為次黃嘌呤。由圖2可知，最佳誘導(dǎo)物質(zhì)量質(zhì)量濃度為3.6 g/L，相對于未添加誘導(dǎo)物時，XOD產(chǎn)率提高了7.3倍。但過高次黃嘌呤的添加對菌體生長及產(chǎn)酶都有抑制作用。后期將采用流加發(fā)酵的方法，以進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)酶。

圖2 次黃嘌呤質(zhì)量濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 Influence of different hypoxanthine concentrations on XOD fermentation

2.3 輔酶前體添加提高分批發(fā)酵產(chǎn)酶

2.3.1 核黃素添加影響發(fā)酵產(chǎn)酶 由圖3可知，添加不同濃度的核黃素影響Arthrobacter M3產(chǎn)黃嘌呤氧化酶。最佳添加質(zhì)量濃度為0.3 mg/L，黃嘌呤氧化酶產(chǎn)率提高了25.5%。這可能是由于黃嘌呤氧化酶含有FAD輔因子，核黃素作為FAD的前體物質(zhì)，添加入培養(yǎng)基后，有利于菌體快速合成足夠的FAD，從而提高菌體產(chǎn)酶。

圖3 核黃素添加對黃嘌呤氧化酶發(fā)酵的影響Fig.3 Effectofriboflavin concentrationson XOD fermentation

2.3.2 硫胺素添加影響發(fā)酵產(chǎn)酶 由圖4可知，硫胺素的添加不同程度的影響菌體產(chǎn)酶，最佳添加質(zhì)量濃度為6 mg/L，黃嘌呤氧化酶產(chǎn)率提高了30.7%，這可能是由于硫胺素以硫胺素焦磷酸輔酶（TPP）的形式參與碳水化合物代謝過程中α-酮酸的氧化脫羧反應(yīng)，是整個能量代謝過程和支鏈氨基酸代謝所必需的維生素。節(jié)桿菌生長及產(chǎn)黃嘌呤氧化酶需耗能，且黃嘌呤氧化酶參與的嘌呤降解代謝，與某些氨基酸的代謝相關(guān)。

圖4 硫胺素添加對黃嘌呤氧化酶發(fā)酵的影響Fig.4 Effectofthiamineconcentrationson XOD fermentation

2.4 流加發(fā)酵提高發(fā)酵產(chǎn)黃嘌呤氧化酶

上述研究表明直接添加過高質(zhì)量濃度次黃嘌呤將抑制菌體生長及產(chǎn)酶，為獲得更高水平的產(chǎn)酶，需對黃嘌呤氧化酶發(fā)酵進(jìn)行流加誘導(dǎo)物。在7.5 L發(fā)酵罐，pH階段控制條件下，測得發(fā)酵至24 h，發(fā)酵液次黃嘌呤約剩余0.3 g/L，葡萄糖濃度約剩余3 g/L。此時進(jìn)行補(bǔ)料，兩種補(bǔ)料方式下發(fā)酵過程參數(shù)變化如圖5及圖6所示。

結(jié)果表明，采用方式1補(bǔ)料后，發(fā)酵至28 h時，發(fā)酵液酶產(chǎn)率提高25.7%。而采用方式2補(bǔ)料時，在第28 h第二次繼續(xù)補(bǔ)料后，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平變化不大；在第31 h第三次再補(bǔ)料時，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平反而下降（下降9.8%）。綜合比較，采用方式1補(bǔ)料較好。

圖5 補(bǔ)料方式1下黃嘌呤氧化酶流加發(fā)酵過程曲線Fig.5 Timecourseofxanthineoxidasefed-batch fermentation via the method one

圖6 補(bǔ)料方式2下黃嘌呤氧化酶流加發(fā)酵過程曲線Fig.6 Timecourseofxanthineoxidasefed-batch fermentation via the method two

2.5 嘌呤代謝產(chǎn)物氨與黃嘌呤氧化酶發(fā)酵的關(guān)系

2.5.1 發(fā)酵過程中銨根離子濃度的變化分析 由圖6知，在采用補(bǔ)料方式2進(jìn)行補(bǔ)料時，雖然后兩次補(bǔ)料對發(fā)酵產(chǎn)酶不利，但發(fā)酵液中所補(bǔ)次黃嘌呤卻已被菌體消耗，發(fā)酵終點時次黃嘌呤質(zhì)量濃度剩余不足0.5 g/L。進(jìn)一步分析，補(bǔ)料方式2的3次補(bǔ)料過程中，其平均產(chǎn)率系數(shù)一直下降，發(fā)酵終點時平均產(chǎn)率系數(shù)僅為補(bǔ)料前的47.3%。

黃嘌呤氧化酶為嘌呤降解代謝酶系中關(guān)鍵酶之一，由京都基因與基因組百科全書（KEGG）報道的節(jié)桿菌嘌呤代謝圖知，次黃嘌呤、黃嘌呤經(jīng)黃嘌呤氧化酶作用后產(chǎn)生尿酸，尿酸再經(jīng)尿酸酶、尿囊素酶等酶系作用，降解為終產(chǎn)物氨。有文獻(xiàn)報道，嘌呤降解時產(chǎn)生的大量中間代謝產(chǎn)物及終產(chǎn)物氨會對嘌呤降解途徑的酶系造成抑制[17]，降低嘌呤降解速率，從而影響黃嘌呤氧化酶的合成。氨在發(fā)酵液中以銨根離子的形式存在，對節(jié)桿菌Arthrobacter M3流加發(fā)酵過程中銨根離子濃度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中銨根離子濃度隨著誘導(dǎo)物的補(bǔ)料而持續(xù)增加（圖7）。推測，在補(bǔ)料方式2下，銨根離子達(dá)到一定濃度時，節(jié)桿產(chǎn)菌黃嘌呤氧化酶受到抑制，第二次補(bǔ)料后產(chǎn)率基本不增加，但菌體仍在生長，導(dǎo)致平均產(chǎn)率系數(shù)開始下降；銨根離子的進(jìn)一步積累加劇了對產(chǎn)酶的抑制，從而導(dǎo)致最后一次補(bǔ)料后，酶產(chǎn)率隨著菌體密度的增加而減小，平均產(chǎn)率系數(shù)下降速率加快。

圖7 補(bǔ)料方式2下流加發(fā)酵過程中銨根離子變化曲線Fig.7 Time course of ammonium concentrations under XOD fed-batch fermentation via the method two

2.5.2 銨根離子濃度抑制發(fā)酵產(chǎn)酶的驗證 有關(guān)文獻(xiàn)報道[14]，嘌呤降解代謝相關(guān)酶的合成受Amr基因表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白的正調(diào)控作用，而Amr基因控制相關(guān)氮源代謝，受到銨根離子的負(fù)調(diào)控作用。高濃度的銨根離子將抑制Amr基因的表達(dá)，從而抑制嘌呤降解代謝相關(guān)酶的合成。為驗證嘌呤代謝終產(chǎn)物氨對節(jié)桿菌Arthrobacter M3發(fā)酵產(chǎn)黃嘌呤氧化酶是否有抑制作用，分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的氯化銨，研究二者的關(guān)系。如圖8所示，當(dāng)向發(fā)酵液中添加15 mmol/L以上的銨根離子時，發(fā)酵液平均產(chǎn)率系數(shù)逐漸減小，進(jìn)而導(dǎo)致黃嘌呤氧化酶產(chǎn)率降低，說明嘌呤代謝產(chǎn)物氨對Arthrobacter M3發(fā)酵產(chǎn)黃嘌呤氧化酶有抑制作用。即黃嘌呤氧化酶的產(chǎn)率與發(fā)酵液中氮源含量及種類有關(guān)，發(fā)酵過程中應(yīng)使用亞適量氮源，避免使用氨水調(diào)節(jié)pH，以減少對發(fā)酵產(chǎn)酶的抑制。

圖8 添加銨根離子對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of ammonium concentrations on XOD fermentation

3 結(jié)語

依據(jù)菌株16S rDNA序列（1438 bp）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定此菌株為球形節(jié)桿菌（Arthrobacter globiformis）；添加輔酶前體（核黃素、硫胺素）不同程度上提高了發(fā)酵產(chǎn)酶；為解除誘導(dǎo)物抑制效應(yīng)，采用兩種流加發(fā)酵方式，結(jié)果表明，在發(fā)酵液中一次性補(bǔ)入4.0 g/L葡萄糖，并補(bǔ)誘導(dǎo)物次黃嘌呤至終質(zhì)量濃度為3.6 g/L，可提高發(fā)酵液黃嘌呤氧化酶產(chǎn)率25.7%。補(bǔ)料方式2下流加發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)后期隨誘導(dǎo)物的補(bǔ)料，酶產(chǎn)率反而下降，且平均產(chǎn)率系數(shù)一直呈下降趨勢。測定知流加發(fā)酵過程中銨根離子濃度持續(xù)增加，推測發(fā)酵后期嘌呤代謝終產(chǎn)物氨可能抑制發(fā)酵產(chǎn)酶。通過向發(fā)酵中添加一定濃度的銨根離子，發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝終產(chǎn)物氨抑制發(fā)酵產(chǎn)黃嘌呤氧化酶。以上研究表明，輔酶前體添加及適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物補(bǔ)料可有效提高黃嘌呤氧化酶發(fā)酵產(chǎn)率，適當(dāng)減少氨氮添加量，避免使用氨水調(diào)節(jié)pH等又可減少對發(fā)酵產(chǎn)酶的抑制，間接提高發(fā)酵產(chǎn)酶量。

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