糖尿病小鼠角膜損害的形態(tài)觀察△

楊碩 王娟 萬(wàn)幸 賀恒 李斌 劉磊

糖尿病是一種糖代謝異常的全身性疾病，眼部并發(fā)癥主要包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病角膜病變、糖尿病性白內(nèi)障等。糖尿病角膜病變主要表現(xiàn)為角膜上皮的缺損、淺表潰瘍以及各種角膜炎等［1-2］，給糖尿病患者造成嚴(yán)重的視覺(jué)威脅。目前針對(duì)糖尿病角膜病變的主要方法是表面潤(rùn)滑和抗生素治療，所有這些方法都是在努力創(chuàng)建一種有效的促進(jìn)角膜損傷愈合的環(huán)境。但是這些方法并沒(méi)有很好地解決糖尿病角膜病變傷口愈合延遲［3］。尋求一種有效的新方法是糖尿病角膜病變研究的核心問(wèn)題。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種因子與糖尿病角膜病變有密切關(guān)系［4-6］。我們?cè)趯?duì)糖尿病并發(fā)眼部疾病的研究過(guò)程中，對(duì)糖尿病小鼠自然飼養(yǎng)環(huán)境下發(fā)生的角膜損傷、角膜潰瘍進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。旨在了解糖尿病小鼠角膜病變發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，對(duì)后期進(jìn)行的糖尿病角膜病變保護(hù)因子的研究提供部分形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)C57BL/J小鼠30只(華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，7～8周齡，雌雄不限。隨機(jī)分為2組。正常對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組(糖尿病造模組)20只。

1.2 糖尿病小鼠造模 開(kāi)始造模前C57BL/J小鼠禁食12 h，腹腔連續(xù)5 d注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國(guó) Sigma 公司)45 mg·kg－1。最后一次注射后7 d，采用割尾法取血，快速血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)檢測(cè)血糖，血糖值大于15.7 mmol·L－1為造模成功［7-8］。每月進(jìn)行血糖檢測(cè)，未達(dá)標(biāo)者淘汰出實(shí)驗(yàn)組。正常對(duì)照組同步處理，檢測(cè)血糖。實(shí)驗(yàn)組共有18只小鼠血糖為高血糖。造模后6個(gè)月時(shí)4只小鼠存在單眼角膜潰瘍，并沒(méi)有小鼠雙眼出現(xiàn)潰瘍改變;正常對(duì)照組小鼠血糖為 4.0 ～7.0 mmol·L－1。

1.3 角膜取材 正常條件下飼養(yǎng)糖尿病小鼠，分別在造模后3個(gè)月、6個(gè)月時(shí)進(jìn)行角膜取材。水合氯醛腹腔注射麻醉后，打開(kāi)胸腔，40 g·L－1多聚甲醛(湖北百奧斯生物)進(jìn)行心臟灌注，小心取出眼球，置于40 g·L－1多聚甲醛中于4℃固定24 h，石蠟包埋，組織切片，厚度為4 μm，HE染色(HE染液由湖北百奧斯生物配制)。光鏡下觀察并照相(×20)。

2 結(jié)果

正常對(duì)照組角膜結(jié)構(gòu)致密，上皮完整(圖1)。造模后3個(gè)月糖尿病小鼠角膜基質(zhì)水腫，部分出現(xiàn)疏松改變，角膜上皮較完整。造模后6個(gè)月糖尿病小鼠角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重稀疏、水腫、增厚，上皮無(wú)明顯缺失，其中發(fā)生潰瘍的角膜，越靠近潰瘍區(qū)水腫、增厚尤甚，潰瘍區(qū)角膜上皮缺損。造模后3個(gè)月、6個(gè)月糖尿病小鼠角膜變化總體為漸進(jìn)性病變，隨病程增加，損害加重(圖2-圖4)。

Figure 1 The corneal structures arranged closely with complete epithelium in control group圖1 正常對(duì)照組小鼠角膜結(jié)構(gòu)致密，上皮完整。

.Figure 2 Mild corneal edema with thick stroma appeared in diabeticmice at 3 months after model establishment圖2 造模后3個(gè)月糖尿病小鼠角膜，可見(jiàn)部分基質(zhì)水腫，疏松改變。

.Figure 3 Corneal stroma with no ulcer was edema and thicken with disorder structure and complete epithelium in diabeticmice at 6 months after model establishment圖3 造模后6個(gè)月糖尿病小鼠未發(fā)生潰瘍的角膜，可見(jiàn)基質(zhì)增厚、水腫，結(jié)構(gòu)疏松，上皮完整。

.Figure 4 Epithelium around the corneal ulcer was incomplete，and the extent of thickening and edema in ulcer area was higher than that in non-ulcer area significantly in diabeticmice at 6 months after model establishment圖4 造模后6個(gè)月糖尿病小鼠已發(fā)生角膜潰瘍，可見(jiàn)基質(zhì)層水腫、疏松程度明顯大于未潰瘍眼和3個(gè)月糖尿病眼，潰瘍區(qū)(箭頭所指)上皮殘缺，基質(zhì)水腫、疏松明顯高于非潰瘍區(qū)

3 討論

糖尿病是一種具有嚴(yán)重危害的全身性代謝性疾病，糖尿病角膜病變是一種糖尿病主要的眼表并發(fā)癥，有47%～64%糖尿病患者會(huì)發(fā)生角膜損傷性的上皮病變［1］。隨著糖尿病患者數(shù)量的增多，可以估計(jì)，角膜病變將會(huì)是擺在眾多糖尿病患者面前的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。正常角膜上皮細(xì)胞通常是作為一種防止眼部感染的屏障，對(duì)維持角膜的透明性和完整性有重要作用［3］。糖尿病患者由于自身病理生理異常，代謝紊亂，導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞發(fā)生異常，出現(xiàn)角膜損傷后愈合緩慢，上皮細(xì)胞松散，黏附性降低。在組織形態(tài)變化上，角膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，基質(zhì)水腫、增厚［3，9-10］。

目前，關(guān)于糖尿病角膜病變的相關(guān)研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種相關(guān)的因子與糖尿病角膜病變發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等在糖尿病角膜病變過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用［4-6］。我們?cè)陂L(zhǎng)期的糖尿病小鼠造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，自然環(huán)境下發(fā)生糖尿病的小鼠會(huì)有部分小鼠出現(xiàn)單眼角膜潰瘍性改變。我們選取了6個(gè)月中發(fā)生單眼潰瘍糖尿病小鼠，HE染色對(duì)比觀察潰瘍眼和無(wú)潰瘍眼角膜以及3個(gè)月、6個(gè)月糖尿病小鼠角膜的形態(tài)變化。糖尿病小鼠造模后3個(gè)月角膜開(kāi)始出現(xiàn)基質(zhì)水腫、增厚，結(jié)構(gòu)松散，角膜剛性結(jié)構(gòu)改變，但上皮大部分完整性尚可，這些改變可能就是糖尿病角膜病變的角膜損害基礎(chǔ);在造模后6個(gè)月糖尿病病程中發(fā)生角膜潰瘍側(cè)角膜結(jié)構(gòu)靠近潰瘍區(qū)水腫增厚明顯，上皮細(xì)胞缺損嚴(yán)重。通過(guò)正常小鼠和造模后3個(gè)月、6個(gè)月糖尿病小鼠角膜病變的對(duì)比觀察，可以明顯發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠角膜病變的漸進(jìn)性過(guò)程。通過(guò)對(duì)糖尿病小鼠角膜病變過(guò)程和潰瘍發(fā)生過(guò)程的形態(tài)學(xué)觀察，了解糖尿病小鼠病程中角膜的階段性損害特點(diǎn)，為在后期研究中探討糖尿病角膜病變保護(hù)因子在各個(gè)損害病程中作用和變化，提供了部分形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)。

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