紫色疣石磺化學成分的分離與鑒定Δ

孫變娜，沈和定，吳洪喜，姚理想，程知慶（.上海海洋大學省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 20306；2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005；3.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，浙江 溫州 325005）

紫色疣石磺（Peronia verruculata）隸屬軟體動物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）肺螺亞綱（有肺類，Pulmonata）縮眼目（Systellommatophora）石磺科（Onchidiidae），柔軟無貝殼，軀體背后部有樹枝狀鰓，有自由生活幼蟲期，被認為是一種進化的貝類[1]。紫色疣石磺多見于我國福建、廣東、海南、香港等地沿海潮間帶的中下部灘涂，越南、泰國等東南亞國家沿海也有分布，范圍較廣，資源豐富。

由于石磺科早期系統(tǒng)分類工作滯后，研究材料屬種不明晰現(xiàn)象嚴重[2]，阻礙了國內(nèi)、外學者對石磺次生代謝產(chǎn)物研究的步伐，至今對石磺類海洋動物的化學成分研究甚少。為尋找石磺類動物的活性成分和有藥用前景的海洋天然產(chǎn)物，科學開發(fā)我國海洋生物資源，筆者對采自我國湛江的紫色疣石磺進行了化學成分研究，從中分得5個化合物，分別鑒定為2，2′-氧代雙（1，4-二叔丁苯）（1）、膽甾醇（2）、α-棕櫚精（3）、尿嘧啶（4）、胸腺嘧啶（5）。其中，化合物1為首次以天然產(chǎn)物形式分離；所有化合物均為首次從紫色疣石磺中分離得到。

1 材料

1.1 儀器

SGW X-4型顯微熔點測定儀（溫度計未校正，上海精密科學儀器有限公司）；AvanceⅡ600型核磁共振光譜（NMR）儀（德國Bruker公司）；6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF LC/MS、1100 LC/MSD Trap型離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；薄層硅膠板（青島海洋化工有限公司）；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；AUY120型電子分析天平（廣州湘儀機電設備有限公司）。

1.2 試劑

Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia公司）；層析用硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿等化學試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；氘代氯仿（美國劍橋同位素實驗室）；水為蒸餾水。

1.3 藥材

石磺材料于2012年11月采自廣東湛江，經(jīng)上海海洋大學沈和定教授鑒定為紫色疣石磺P.verruculata，憑證標本保存在上海海洋大學海洋貝類實驗室（No.12 DZ-1）。

2 提取與分離

將新鮮紫色疣石磺解剖、去內(nèi)臟，濕質(zhì)量約3kg，剪碎，用甲醇（5 L）于室溫下浸提3次，每次7 d。合并提取液，減壓回收溶劑（至無醇味），將浸膏分散于500ml蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，減壓回收溶劑，分別得石油醚萃取物15.5g、乙酸乙酯萃取物27.2g、正丁醇萃取物18.9 g。將石油醚和乙酸乙酯萃取物分別進行硅膠（200～300目）柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯（100∶0→0∶100，V/V）洗脫系統(tǒng)梯度洗脫，得到A～F 6個組分。其中，B組分以石油醚-乙酸乙酯（90∶10，V/V）洗脫，經(jīng)反復硅膠柱層析，得到化合物1（19.2mg）；石油醚-乙酸乙酯（80∶20，V/V）和石油醚-乙酸乙酯（75∶25，V/V）洗脫段經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，分別得化合物2（12.7mg）和3（12.7mg）。D組分經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以氯仿-甲醇（1∶1，V/V）洗脫，經(jīng)反相硅膠柱層析，再以甲醇-水（2∶1，V/V）洗脫，得到化合物4（7.4mg）和5（10.3mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1:淡黃色油狀物；HR-ESI-MS（m/z）:394.3296[M+H]+（計算值為394.3236）；UV λmax（MeOH）:294nm?；衔?的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見表1。由表1可知，氫譜高場區(qū)為2個積分為9的信號，低場區(qū)為3個積分為1的信號；碳譜共有10個信號。結(jié)合分子質(zhì)量推斷，該化合物應為對稱結(jié)構(gòu)。該化合物共有28個碳、42個氫。根據(jù)分子質(zhì)量可知，該化合物除了碳和氫之外，還有一個氧原子。因此，該化合物分子式應為C28H42O。從氫譜高場區(qū)的2個積分為9的信號δ1.29和1.33推斷，該分子應有兩種化學環(huán)境不同的叔丁基，碳譜δ31.4、30.2、34.9、34.5也證明了這一點。氫譜低場區(qū)的3個氫的耦合常數(shù)明顯符合1，2，4三取代苯的特點。碳譜芳香區(qū)有6個信號，也支持這個推斷。通過HMBC和NOESY可以推斷出，2個叔丁基分別處于苯環(huán)的1位和4位；2位碳的化學位移較大，應該是和氧相連的碳；氧原子處于該分子的對稱中心。因此，本化合物被鑒定為2，2’-氧代雙（1，4-二叔丁苯）。本結(jié)構(gòu)此前已被合成獲得[3]，而本研究中為首次以天然產(chǎn)物形式分離得到。化合物1的結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物2:白色片狀晶體，mp:144～146Ⅱ。ESI-MS（m/z）:387[M+1]+。1H-NMR（600MHz，CDCl3）δ:5.30（1 H，d，J＝4.3 Hz，H-6），3.48（1 H，m，H-3），1.01（3 H，s，H-19），0.91（3 H，d，J＝6.6Hz，H-21），0.87（3 H，d，J＝6.7Hz，H-26），0.86（3 H，d，J＝6.7Hz，H-27），0.64（3 H，s，H-18）；13C-NMR（150MHz，CDCl3）δ:140.9（C-5），121.8（C-6），71.8（C-3），56.9（C-14），56.3（C-17），50.2（C-9），42.4（C-4，13），39.9（C-12），39.7（C-24），37.4（C-1），36.6（C-10），36.3（C-22），36.0（C-20），32.0（C-7），32.0（C-8），31.7（C-2），28.4（C-16），28.2（C-25），24.5（C-15），24.0（C-23），23.0（C-27），22.8（C-26），21.2（C-11），19.6（C-19），18.9（C-21），12.0（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻[4-5]報道一致，故鑒定其為膽甾醇。

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR（CDCl3，600/150MHz）數(shù)據(jù)Tab 1 1H-NMR and13C-NMR（CDCl3，600/150MHz）data of compound 1

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of compound 1

化合物3:白色片狀結(jié)晶，mp:70～72Ⅱ。ESI-MS（m/z）:331[M+H]+。1H-NMR（600MHz，CDCl3）δ:4.20（1 H，dd，J＝11.5，4.5Hz，H-1′a），4.15（1 H，dd，J＝11.5，6.5Hz，H-1′b），3.93（1 H，m，H-2′），3.69（1 H，dd，J＝11.5，4.0Hz，H-3′b），3.60（1 H，dd，J＝11.5，5.5Hz，H-3 a），2.35（2 H，t，J＝7.5Hz，H-2），1.62（2 H，m，H-3），1.26～1.30（24h，m），0.88（3 H，t，J＝7.0Hz，H-16）；13C-NMR（150MHz，CDCl3）δ:70.3（C-1′），65.2（C-2′），63.3（C-3′），174.4（C-1），34.2（C-2），31.9（C-3），29.7～29.3（C-4～13），24.9（C-14），22.7（C-15），14.1（C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故鑒定其為α-棕櫚精。

化合物4:淡黃色針狀結(jié)晶，mp:308～311Ⅱ。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）δ:10.95（1 H，s，N-H），10.81（1 H，s，N-H），7.51（1 H，t，J＝7.6Hz，H-6），5.49（1 H，d，J＝7.6Hz，H-5）；13C-NMR（150MHz，DMSO-d6）δ:164.5（C-1），151.6（C-2），142.9（C-6），102.1（C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，故鑒定其為尿嘧啶。

化合物5:淡黃色針狀結(jié)晶，mp:333～335Ⅱ。ESI-MS（m/z）:125（M-H）－。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）δ:10.98（1 H，s，N-H），10.51（1 H，s，N-H），7.27（1 H，s，H-6），1.72（3 H，s，5-CH3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ:164.9（C-4），151.4（C-2），137.7（C-6），107.6（C-5），11.9（5-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道一致，故鑒定其為胸腺嘧啶。

4 討論

石磺產(chǎn)品已在江蘇鹽城（俗稱海癩子）、浙江溫州（俗稱涂龜）、福建寧德（俗稱土鮑）等地形成廣泛的市場。民間流傳石磺有治哮喘、治風濕病、滋補、助消化、消除疲勞、明目的功效；冰糖燉石磺據(jù)說對治療哮喘有特效，并常被作為產(chǎn)后婦女良好的滋補品。沿海居民食用石磺的歷史悠久[2]。在《中國海洋藥物辭典》中有如下記載:石磺別名土海參，四季捕撈，捕后洗凈，除去內(nèi)臟，取肉鮮用；肉入藥，有滋補強壯之功效，主治肝硬化、久病體虛等癥狀[9]。近幾年國內(nèi)石磺產(chǎn)品供不應求，已從越南等國大量進口。目前國內(nèi)、外對石磺的研究主要集中在系統(tǒng)分類[1，10-12]、生物學特性[13-15]、受精機制[16]、繁殖[17-19]、胚胎發(fā)育[20-21]、神經(jīng)系統(tǒng)[22]、營養(yǎng)價值[23]、國內(nèi)外石磺活性物質(zhì)研究現(xiàn)狀[2]等方面。其中，Marianna C等[24]從中國石磺Onchidium sp.中分離獲得一種吡喃酮聚丙酸酯，Wang JR等[25]再次從中分得3個聚丙酸酯類化合物，實為我國石磺二次代謝產(chǎn)物研究的先例。

本研究通過對紫色疣石磺甲醇提取物的石油醚、乙酸乙酯部位進行化學成分的分離純化，分離并鑒定出5個化學成分，其中化合物1為首次以天然產(chǎn)物形式分離，所有化合物均為首次從紫色疣石磺中分離得到。本研究結(jié)果可為石磺這一特色海洋中藥資源的綜合利用與開發(fā)提供理論依據(jù)。

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