白芍總苷對葡萄膜炎模型大鼠的保護(hù)作用Δ

吳 偉，何梅鳳，郭澤莉，黃祥坤，鐘建文（中山大學(xué)中山眼科中心，廣州 510060）

葡萄膜炎是眼科常見的致盲眼病之一，病因和致病機(jī)制復(fù)雜，主要與自身免疫有關(guān)，其治療以糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、他克莫司等免疫抑制劑為主，但此類藥物往往因毒副作用大而使有些患者不能耐受，給臨床治療帶來極大的困難。因此，亟需開發(fā)新的安全有效藥物治療葡萄膜炎。白芍總苷是我國傳統(tǒng)中藥白芍根中提取的有效成分，廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性蕁麻疹等多種疾病的治療[1-3]，在炎癥免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用。本研究通過內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)的葡萄膜炎模型大鼠，初步探討白芍總苷對葡萄膜炎模型大鼠的保護(hù)作用，以期為葡萄膜炎的臨床治療提供一種新的選擇。

1 材料

1.1 儀器

Axioplan 2型熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）；SL-D7/DC-3型裂隙燈數(shù)碼圖像處理系統(tǒng)（日本Topcon公司）。

1.2 內(nèi)毒素與藥品

傷寒桿菌（LPS，美國Sigma公司，批號:032 M4002 V）；白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司，批號:120312，規(guī)格:0.3 g/粒）；醋酸潑尼松片（天津藥業(yè)焦作有限公司，批號:12040411，規(guī)格:5mg/片）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠32只，♀♂兼用，體質(zhì)量200～220 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號:SCXK（粵）2011-0015]。

2 方法

2.1 復(fù)制模型

[4]方法，將LPS溶于生理鹽水中，使之終質(zhì)量濃度為2 g/L，分別在SD大鼠的雙后足底部注射50μl以復(fù)制大鼠葡萄膜炎模型。

2.2 分組與給藥

32只SD大鼠隨機(jī)均分為4組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、白芍總苷（4.8 g/kg）組、醋酸潑尼松（0.05mg/kg）組。于復(fù)制模型前ig給藥，白芍總苷每隔6h給藥1次，共3次；醋酸潑尼松僅單次給藥。

2.3 大鼠眼部臨床表現(xiàn)觀察

分別于注射LPS 6、12、18、24、36、48 h后，用裂隙燈顯微鏡觀察大鼠眼部臨床表現(xiàn)，參照文獻(xiàn)[5]臨床評分方法:虹膜充血，0～2分；前房內(nèi)滲出，0～2分；前房積膿，0～2分；瞳孔縮小，0～2分；總分為8分。

2.4 病理學(xué)檢查

于注射LPS 18、24、36、48 h后各組隨機(jī)處死2只大鼠，取眼球作病理檢查。鹽酸氯胺酮（0.3ml）和鹽酸氯丙嗪（0.3ml）混合后ip大鼠進(jìn)行麻醉。沿胸骨兩側(cè)剪開胸腔，暴露心臟，心尖部注射0.3ml肝素鈉注射液（1500u/ml），用4Ⅸ預(yù)冷的0.01 mol/L PBS緩慢灌注，直到肝臟變白，再用40ml/L多聚甲醛溶液灌注固定。小心摘取眼球置40ml/L多聚甲醛溶液中固定24h。作常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示。組間單因素比較先用單因素分析其正態(tài)分布，后以LSD法進(jìn)行統(tǒng)計，方差不齊時，各組間兩兩比較采用Tamhance’s T2檢驗。不同時間點測定同一數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白芍總苷對模型大鼠眼部炎癥的影響

正常對照組大鼠未見炎癥發(fā)生。模型組大鼠注射LPS 6h開始出現(xiàn)瞳孔縮小，結(jié)膜充血，虹膜血管輕度擴(kuò)張，并表現(xiàn)出畏光；12h時瞳孔進(jìn)一步縮小，結(jié)膜、虹膜充血加重，瞳孔緣開始出現(xiàn)纖維素樣滲出；18h時炎癥進(jìn)一步加重；24h時達(dá)炎癥的高峰，大鼠瞳孔顯著縮小，虹膜充血明顯，前房纖維素樣滲出明顯增多，甚至前房積膿。白芍總苷組大鼠注射LPS 6h結(jié)膜輕度充血；12h時開始出現(xiàn)瞳孔縮小，虹膜輕度充血，并表現(xiàn)出畏光；18～24h時，瞳孔進(jìn)一步縮小，虹膜充血明顯，瞳孔區(qū)靠近虹膜緣處隱約見少量纖維素樣滲出，但前房內(nèi)未見白色積膿。注射LPS 36h后各組大鼠炎癥開始減退。各時間點與模型組比較，白芍總苷組大鼠眼部炎癥臨床評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。大鼠眼部炎癥臨床評分見表1（正常對照組僅作參考，表中未列出）。

表1 大鼠眼部炎癥臨床評分（）Tab 1 The clinical score of ocular inflammation in rats（）

表1 大鼠眼部炎癥臨床評分（）Tab 1 The clinical score of ocular inflammation in rats（）

與模型組比較:＊P＜0.05vs.model group:＊P＜0.05

時間12h（n＝16）總評分3.12±0.722.00±0.37＊1.81±0.40＊6.5±0.823.69±0.70＊3.56±0.51＊6.67±0.894.08±0.67＊3.92±0.67＊炎癥臨床評分18h（n＝16）24h（n＝12）組別模型組白芍總苷組醋酸潑尼松組模型組白芍總苷組醋酸潑尼松組模型組白芍總苷組醋酸潑尼松組虹膜充血1.56±0.511.06±0.251.00±0.002.00±0.001.50±0.521.44±0.512.00±0.001.50±0.521.50±0.52前房內(nèi)滲出0.38±0.500.00±0.000.00±0.001.63±0.500.81±0.400.69±0.491.67±0.491.00±0.430.92±0.51前房積膿0.00±0.000.00±0.000.00±0.001.06±0.570.00±0.000.00±0.001.08±0.510.00±0.000.00±0.00瞳孔縮小1.19±0.400.94±0.250.88±0.341.81±0.401.38±0.501.44±0.511.92±0.291.58±0.511.5±0.52

3.2 白芍總苷對模型大鼠眼部病理學(xué)的影響

正常對照組未見炎癥發(fā)生。注射LPS 18h后模型組大鼠虹膜睫狀體水腫明顯，前后房、玻璃體內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤，前房內(nèi)纖維素樣滲出明顯，視網(wǎng)膜水腫增厚，有炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥的高峰期持續(xù)至24h。白芍總苷組大鼠眼部炎癥較模型組明顯減輕，在炎癥的高峰期虹膜睫狀體水腫明顯減輕，僅有少量的炎癥細(xì)胞浸潤，前房有少量的纖維素樣滲出，視網(wǎng)膜的浸潤細(xì)胞明顯減少。注射LPS 36h時各組大鼠眼部炎癥開始減退，虹膜睫狀體腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤、前房纖維素樣滲出等炎癥表現(xiàn)均較24h時明顯減輕。48 h眼部炎癥已基本減退。注射LPS 24h后大鼠眼前段和后段的病理學(xué)改變見圖1、圖2。

圖1 注射LPS 24h后大鼠眼前段組織病理學(xué)改變A.正常對照組；B.模型組；C.白芍總苷組；D.醋酸潑尼松組Fig 1 Histopathological change in anterior segment of eye in rats 24h after injection of LPS for 24hoursA.normal control group；B.model group；C.TGP group；D.prednisone acetate group

圖2 注射LPS 24h后大鼠眼后段組織病理學(xué)改變A.正常對照組；B.模型組；C.白芍總苷組；D.醋酸潑尼松組Fig 2 Histopathological change in posterior segment of eye in rats 24h after injection of LPSA.normal control group；B.model group；C.TGP group；D.prednisone acetate group

4 討論

近年研究顯示，白芍總苷可通過多種途徑發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。劉國玲等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥有抑制作用，其機(jī)制可能與下調(diào)NF-kB/p65蛋白的表達(dá)，降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1 β的水平有關(guān)。劉朝東等[7]觀察了白芍總苷對慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的作用，發(fā)現(xiàn)白芍總苷可能通過抑制CD3+T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤，降低IL-6等促炎癥細(xì)胞因子的過高表達(dá)。謝長江等[8]研究顯示，白芍總苷能降低IL-1、IL-6及TNF-α水平，減輕膿毒血癥模型大鼠的炎癥反應(yīng)及肺組織的損傷程度，降低病死率。此外，白芍總苷能抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞增殖，下調(diào)β抑制蛋白-2的表達(dá)，并能降低血清促炎癥細(xì)胞因子IL-1 β、TNF-α和前列腺素（PG）E2水平，從而對模型大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生抑制作用[9-12]；白芍總苷還能抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及TNF-α、IL-6過度分泌[13-14]。由此可見，白芍總苷可以在多個環(huán)節(jié)影響自身免疫疾病的細(xì)胞免疫、體液免疫以及炎癥過程，減輕自身免疫性炎癥反應(yīng)。在眼科臨床，有學(xué)者應(yīng)用白芍總苷治療內(nèi)因性葡萄膜炎發(fā)現(xiàn)，它能改善患者細(xì)胞與體液免疫異常狀況，并有一定的治療作用[15]。提示其對緩解葡萄膜炎的炎癥反應(yīng)可能起著一定的作用，具有潛在的應(yīng)用價值。

本研究選用大鼠葡萄膜炎模型，以ig給藥方式探討了白芍總苷對葡萄膜炎的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白芍總苷對模型大鼠的臨床癥狀、疾病進(jìn)程、病理進(jìn)程均有不同程度減輕，其主要原因可能與白芍總苷的抗炎及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，但尚需進(jìn)一步研究驗證。同時，白芍總苷不良反應(yīng)少，并且還有肝臟保護(hù)作用，有良好的耐受性[16-17]。因此，對于因自身免疫原因而反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，需長期規(guī)范用藥才能控制的葡萄膜炎，以及不宜應(yīng)用強(qiáng)效免疫抑制劑或激素治療的葡萄膜炎患者，白芍總苷將是一種較為理想的藥物。

參考文獻(xiàn)

[1]張源潮，孫紅勝，潘正論，等.白芍總苷在風(fēng)濕免疫病中的研究進(jìn)展[J].世界臨床藥物，2010，31（8）:449.

[2]胡長玲，林兵，鄭承劍，等.抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的天然藥物及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中草藥，2011，42（7）:1435.

[3]賈瑜，雷山川，陳元，等.白芍總苷膠囊對慢性蕁麻疹T細(xì)胞免疫平衡的影響[J].中國藥房，2012，23（24）:2240.

[4]馬翠萍，楊培增，鐘暉，等.漢防己堿對實驗性葡萄膜炎的抑制作用[J].中山大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2003，24（1）:74-76.

[5]Hoekzema R，Murray PI，Haren MAC，et al.Analysis of interleukin-6in endotoxin induced uvitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32（1）:88.

[6]劉國玲，李宜川，沈永杰.白芍總糖苷對RA大鼠足爪組織中NF-κB/p65蛋白表達(dá)的抑制作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2010，26（11）:1082.

[7]劉朝東，王洪志，韋超.白芍總苷對慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞及IL-6的影響研究[J].中國藥房，2009，20（12）:891.

[8]謝長江，謝富華，張珊珊，等.白芍總苷對膿毒癥大鼠模型的抗炎作用研究[J].新醫(yī)學(xué)，2012，43（8）:576.

[9]吳華勛，陳鏡宇，汪慶童，等.白芍總苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜β抑制蛋白的影響與其抑制滑膜細(xì)胞增殖的關(guān)系[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28（7）:934.

[10]Chang Y，Wei W，Zhang L，et al.Effects and mechanisms of total glucosides of paeony on synoviocytes activities in rat collagen-induced arthritis[J].J Ethnopharmacol，2009，121（1）:43.

[11]Wang QT，Zhang LL，Wu HX，et al.The expression change of beta-arrestins in fibroblast-like synoviocytes from rats with collagen-induced arthritis and the effect of total glucosides of paeony[J].J Ethnopharmacol，2011，133（2）:511.

[12]常景芝，王琛，陳劍，等.白芍總苷對大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎足爪組織基質(zhì)金屬蛋白酶9及血清中炎性細(xì)胞因子IL-β及TNF-α表達(dá)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（9）:2187.

[13]Cao W，Zhang W，Liu J，et al.Paeoniflorin improves survival in LPS-challenged mice through the suppression of TNF-alpha and IL-1 beta release and augmentation of IL-10 production[J].Int Immunopharmacol，2011，11（2）:172.

[14]Liu DF，Wei W，Song LH.Protective effect of paeoniflorin on immunological liver injury induced by bacillus calmetteguerin plus 1 ipopo1 ysaccharide:modulation of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-6mRNA[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33（4）:332.

[15]張銘端，黃叔仁，陳敏珠.白芍總苷對內(nèi)因性葡萄膜炎患者的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中華眼底病雜志，1994，10（3）:146.

[16]賀燁，范佳妮，余靈瑛.白芍總苷對急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2010，8（17）:71

[17]王云萍.白芍總苷聯(lián)合免疫抑制劑治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎對肝功能的影響[J].基層醫(yī)學(xué)論壇，2012，16（13）:1644.