冬凌草甲素下調(diào)STAT3-HKⅡ通路誘導(dǎo)Hep G2細胞凋亡的研究

王天曉，劉迎滑，時小燕

（河南大學(xué)中藥研究所，藥學(xué)院，河南開封 475004）

腫瘤細胞所需的能量主要由葡萄糖的氧化供應(yīng)，腫瘤細胞糖代謝的主要特征是糖酵解明顯增強。造成腫瘤細胞糖酵解增強的主要原因與該細胞的酵解酶的過表達及活性增強有關(guān)。抑制這些酶的表達和活性，阻斷糖酵解的進行，可使腫瘤細胞因能量供應(yīng)缺乏而死亡，但正常細胞不受影響。己糖激酶（hexokinase，HK）是調(diào)節(jié)細胞糖酵解的關(guān)鍵限速酶。在惡性腫瘤細胞中，以HK-Ⅱ亞型高表達為主，HK-Ⅱ除了具有糖代謝酶的催化活性，還具有拮抗細胞凋亡的功能［1－3］。因此，抑制 HK-Ⅱ 可抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。冬凌草甲素（Oridonin）具有抗腫瘤活性，但其對腫瘤細胞糖代謝的調(diào)控作用還未見報道。因此，本研究探討冬凌草甲素對人肝癌HepG2細胞中HK-Ⅱ的影響，以進一步研究其新的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司；MTT購于Sigma公司；RT-PCR試劑盒為北京全式金生物公司產(chǎn)品；STAT3、pSTAT3和 HK-Ⅱ一抗 為 Cell Signaling technology公司產(chǎn)品；β-actin一抗 和HRP標(biāo)記二抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Hoechst 33342和PI為碧云天產(chǎn)品。冬凌草甲素由河南大學(xué)藥學(xué)院康文藝老師饋贈。HK-Ⅱ抑制劑3-溴丙酮酸（3-Bromopyruvic acid，3-BrPA）購于 Alfa Aesar公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細胞用含10%血清、100 kU·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.3 細胞增殖檢測 對數(shù)生長期的HepG2細胞，調(diào)整細胞密度至5×107·L－1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，24 h后分別用 0、5、10、20、30 mg·L－1冬凌草甲素或3-BrPA處理細胞，48 h后每孔加5 g·L－1MTT 10μl，37℃繼續(xù)孵育 4 h，棄上清，每孔加入150μl DMSO，酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光值（A值），計算細胞抑制率。

1.4 細胞凋亡檢測 Hoechst 33342／PI雙染檢測細胞凋亡：收集對數(shù)生長期的HepG2細胞，調(diào)整細胞密度至5×107·L－1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，24 h后分別用0、10、20、30 mg·L－1冬凌草甲素或 3-BrPA處理細胞，48 h后，PBS洗滌2次，加入PBS 80 μl，加入 PI染液，終濃度 5 mg·L－1，4℃避光染色 60 min，再加入 Hoechst 33342染液，終濃度5 mg·L－1，37℃避光染色20 min，再用 PBS洗滌2次，加入100 μl PBS后用Arrary ScanVTIHCS600型高內(nèi)涵成像系統(tǒng)觀察照相，同時檢測PI的熒光強度。

1．5 STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染 HepG2細胞接種于6孔板，待細胞匯合度為30%～40%時進行STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染，以Lipofectamine 2000為轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染48h后，收集細胞，提取細胞總RNA和細胞總蛋白，進行RT-PCR和Western blot分析。STAT3特異性siRNA的序列為 sense：5′-CCCGUCAACAAAUUAAG AAdTdT-3′，antisense：5′-UUCUUAAUUU GUUGACG GG dTdT-3′，由Invitrogen公司合成。

1．6 RT-PCR 經(jīng) 0、10、20、30 mg·L－1冬凌草甲素或STAT3 siRNA處理48 h后的HepG2細胞，應(yīng)用TRIzol試劑提取細胞總RNA，利用RT-PCR試劑盒擴增 HK-Ⅱ 和 STAT3 mRNA。HK-Ⅱ-Forward primer：5′TCTGCTTGCCTACTTCTTC3′，HK-Ⅱ-Reverse primer：5′TTCTCCATCTCCACCTTCT3′，Product length：312bp；STAT3-Forward primer：5′CCAAGGAGGAGGCATTCG3′， STAT3-Reverse primer 5′ACATCGGCAGGTCAATGG3′，擴增片段 147 bp。βactin為內(nèi)參，引物序列為5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′，擴增片段305 bp。

1．7 Western blot 收集經(jīng) 0、10、20、30 mg·L－1冬凌草甲素或3-BrPA處理48 h后的HepG2細胞，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解15 min后，超聲勻漿提取細胞總蛋白并定量?？偟鞍捉?jīng)10%SDSPAGE膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5% 脫脂牛奶封閉 1 h，加入 HK-Ⅱ、STAT3和pSTAT3一抗4℃過夜，洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，再洗膜3次，通過ECL試劑盒進行顯影檢測。β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0應(yīng)用軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，進行方差分析及t檢驗。

Fig 1 Oridonin inhibits the expression of HK-Ⅱ

2 結(jié)果

2．1 Hep G2細胞中HK-Ⅱ的表達及冬凌草甲素對其表達的影響 RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，HepG2細胞中有高表達的HK-Ⅱ，而且冬凌草甲素作用后，可劑量依賴性地降低HepG2細胞中HK-ⅡmRNA及蛋白表達水平（Fig 1）。

2．2 冬凌草甲素下調(diào)HK-Ⅱ?qū)ep G2細胞增殖及凋亡的影響 MTT結(jié)果顯示，冬凌草甲素可劑量依賴性地抑制HepG2細胞生長，其對HepG2細胞的IC50為20.45 mg·L－1。3-BrPA作為 HK特異性抑制劑能夠抑制腫瘤細胞的糖酵解和氧化磷酸化過程，使腫瘤細胞因ATP供應(yīng)不足而死亡［4］。因此本研究以3-BrPA作為陽性對照，MTT結(jié)果顯示，濃度在30 mg·L－1以下時，冬凌草甲素的抑制腫瘤細胞增殖作用略弱于3-BrPA，當(dāng)濃度達30 mg·L－1時，冬凌草甲素的抗腫瘤細胞增殖活性與3-BrPA作用相當(dāng)（Fig 2）。

高內(nèi)涵活細胞成像系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，冬凌草甲素處理的HepG2細胞內(nèi)PI的熒光強度明顯增加，表明冬凌草甲素可促進HepG2細胞發(fā)生晚期凋亡和壞死，其促細胞凋亡作用也與3-BrPA相當(dāng)（Fig 3）。

同時，用3-BrPA作用HepG2細胞24 h來抑制HK-Ⅱ，然后檢測冬凌草甲素對HepG2細胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示3-BrPA抑制HK-Ⅱ后，冬凌草甲素對HepG2細胞的抑制作用被消除（Fig 4A、B），由此表明冬凌草甲素可通過抑制HK-Ⅱ來發(fā)揮其抗腫瘤活性。

2．3 冬凌草甲素對STAT3-HK-Ⅱ通路的影響STAT3作為一種由細胞因子等激活的轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控相關(guān)生長基因的表達水平來影響腫瘤細胞的生長及凋亡，其過度激活及表達與腫瘤細胞的增殖、凋亡密切相關(guān)。那么STAT3與HK-Ⅱ基因之間的關(guān)系如何，STAT3是否調(diào)控HK-Ⅱ的表達，冬凌草甲素是否通過影響STAT3表達來抑制HK-Ⅱ的表達？為探討STAT3與HK-Ⅱ基因之間的關(guān)系，我們通過STAT3 siRNA下調(diào) STAT3，觀察 HK-ⅡmRNA及蛋白表達水平以及細胞凋亡狀態(tài)。結(jié)果顯示，STAT3 siRNA可明顯降低HK-Ⅱ mRNA及蛋白水平（Fig 5A），表明轉(zhuǎn)錄因子STAT3對HK-Ⅱ具有調(diào)控作用；我們又觀察不同濃度冬凌草甲素對HepG2細胞中STAT3、pSTAT3及HK-Ⅱ表達的影響，結(jié)果顯示，冬凌草甲素可劑量依賴性地下調(diào)HepG2細胞中STAT3 mRNA及STAT3、pSTAT3和HK-Ⅱ蛋白表達水平（Fig 5B）。而且STAT3 siRNA抑制 STAT3后，再用冬凌草甲素作用HepG2細胞24 h，此時冬凌草甲素對細胞增殖及凋亡的影響被消除（Fig 5C、D）。由此進一步表明冬凌草甲素可通過抑制STAT3的表達及活性來抑制HK-Ⅱ的表達，從而抑制HepG2細胞的生長，促進HepG2細胞的凋亡。

Fig 2 Effect of oridonin on Hep G2 cell proliferation（ˉx±s）

Fig 3 Effect of oridonin on HepG2 cell apoptosis（ˉx±s）

Fig 4 Effect of oridonin on cell proliferation and apoptosis after 3-Br PA inhibiting HK-Ⅱ（ˉx±s）

Fig 5 Effect of oridonin on STAT3-HK-Ⅱ pathway

3 討論

Warburg在20世紀20年代首次報道肝癌細胞比正常肝細胞糖酵解代謝活躍，即使在供氧充足條件下，惡性腫瘤細胞糖酵解也明顯增強，即有氧糖酵解［5－6］。進一步的研究顯示，活躍的糖酵解代謝表型存在于大多數(shù)惡性腫瘤細胞中。HK是糖酵解代謝的第一個關(guān)鍵限速酶，它催化葡萄糖轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖。目前已知人類有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4種同工酶，其中HK-Ⅱ 亞型與惡性腫瘤相關(guān)性最大，在許多惡性腫瘤細胞中高表達，而且HK-Ⅱ 不僅具有糖酵解代謝酶的催化活性，還有拮抗細胞凋亡的作用［1－3］。惡性腫瘤細胞糖酵解代謝受細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，STAT3作為細胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子，與細胞增殖和凋亡關(guān)系密切，在很多惡性腫瘤中過度表達和活化［7－8］。抑制 STAT3的表達或活化可抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡［9－11］。

本研究結(jié)果顯示，STAT3和HK-Ⅱ 基因在人肝癌HepG2細胞中呈過表達或高水平表達，因此抑制STAT3和（或）HK-Ⅱ的表達及活性，可抑制HepG2細胞生長。本研究顯示，冬凌草甲素可劑量依賴性地抑制STAT3和HK-Ⅱ的表達及活性，抑制HepG2細胞生長、促進HepG2細胞凋亡；STAT3 siRNA可明顯降低HK-Ⅱ的mRNA和蛋白水平；同時應(yīng)用STAT3 siRNA干涉STAT3，3-BrPA抑制HK-Ⅱ，研究冬凌草甲素對HepG2細胞生長及凋亡的影響，結(jié)果顯示STAT3和HK-Ⅱ分別被抑制后，冬凌草甲素對HepG2細胞的生長抑制被消除。上述結(jié)果表明，冬凌草甲素可通過抑制STAT3的表達及活性來抑制HK-Ⅱ的表達及活性，從而抑制HepG2細胞的生長，促進HepG2細胞的凋亡。

總之，冬凌草甲素可通過下調(diào)STAT3-HK-Ⅱ通路誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。

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