噬菌體展示篩選人源細(xì)胞黏附分子L1結(jié)構(gòu)域抗體及其體外實(shí)驗(yàn)研究

趙煒疆，潘洪超，李桂林，董麗萍，唐丹陽

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，廣東汕頭 515041；2.首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100050）

脊髓損傷是嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，對抗損傷后出血、水腫、微循環(huán)障礙以及局部氧自由基作用所造成的神經(jīng)元損傷，促進(jìn)損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)、改善臨床癥狀是治療脊髓損傷的重要目的。L1系免疫球蛋白超家族成員，主要表達(dá)于分化中的神經(jīng)元軸突及生長錐，參與神經(jīng)細(xì)胞遷移、存活以及神經(jīng)突形成［1－2］，在損傷后神經(jīng)再生中發(fā)揮重要作用。已有報(bào)道使用小鼠源性激動型L1抗體可激活L1功能，增強(qiáng)周圍神經(jīng)軸突再生和髓鞘形成，促進(jìn)損傷后功能恢復(fù)［3－4］。這些提示激活脊髓損傷部位L1，進(jìn)而激活一系列與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)的信號級聯(lián)反應(yīng)可能是促進(jìn)脊髓損傷后結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)擬通過噬菌體展示技術(shù)篩選并純化針對L1 FN2-3區(qū)的人源結(jié)構(gòu)域抗體，并檢測其抗原結(jié)合特性和對L1下游信號激活、神經(jīng)突生長及神經(jīng)細(xì)胞聚集的影響，進(jìn)而為實(shí)驗(yàn)性治療研究神經(jīng)損傷打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)構(gòu)域抗體庫（Human Domain Antibody Library，DAb library）購自 Source BioScience LifeSciencesTM（Nottingham，英國）；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（CTCC）。DMEM-F12低糖培養(yǎng)液及青霉素／鏈霉素、RIPA細(xì)胞裂解液（北京索萊寶公司）；胎牛血清（杭州四季青生物技術(shù)有限公司）；8孔Lab-Tek小室載玻片 （Nunc公司）。小鼠抗pErk1／2、Erk、pAkt1及 Akt1抗體（Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，美國），兔抗c-Myc抗體（生工生物，上海），小鼠抗GAPDH抗體（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），ECL超敏發(fā)光液 （Biorad，美國）及Pro-Long Gold Antifade reagent with DAPI抗熒光衰減封片劑 （Life technologies，美國）。驢抗小鼠DylightTM488及驢抗兔DylightTM594熒光二抗（Jackson Immuno Research公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體展示技術(shù)篩選L1結(jié)構(gòu)域抗體 ①

包被：將100μl溶于 PBS的 L1 FN2-3肽段（濃度200 mg·L－1）包被于96孔板中，4℃過夜，吸出未包被上的液體，用200μl 3%BSA在室溫下封閉1 h。②結(jié)合：棄去封閉液將滴度為1013的人結(jié)構(gòu)域噬菌體抗體庫（溶于100μl PBS）加入包被好的孔中，室溫下孵育1 h。③洗脫：將未結(jié)合的噬菌體吸出，用200μl含0.1%Tween-20的PBS（PBST），室溫下洗脫10次，每次1 min，然后用200μl PBS洗脫2次，每次10 min。最后，加入100 mg·L－1胰蛋白酶，室溫下孵育30 min。④ 接種：吸出噬菌體，加入到預(yù)先培養(yǎng)好的600 nm OD值為0.4的30 ml新鮮大腸桿菌TG1菌液中，37℃下振蕩孵育1 h。然后，將菌液在3 200×g下離心10 min，將被噬菌體侵染的大腸桿菌溶于1 ml 2×TY培養(yǎng)基中。取出10μl，梯度稀釋接種于預(yù)熱的含100 mg·L－1青霉素的TYE板上進(jìn)行滴度測定，剩余菌液4℃12 000×g離心5 min后用50μl 2×TY培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于TYE平板上于恒溫培養(yǎng)箱中37℃過夜。⑤擴(kuò)增：利用培養(yǎng)液洗脫菌落，溶于50 ml 2×TY培養(yǎng)液中，當(dāng)菌落生長至 OD600nm為0.4時，加入 1010輔助噬菌體KM13，置于37℃水浴1 h。然后離心，并加入50 ml新鮮培養(yǎng)液（含100 mg·L－1氨芐霉素和50 mg·L－1卡那霉素以及1%葡萄糖），放置于恒溫?fù)u床，250 r·min－1振蕩，37℃過夜。再次將菌液3 200×g離心10 min。收集上清，按照1∶4的比例加入聚乙二醇／氯化鈉溶液，置于冰上1 h。隨后，12 000×g離心10 min。最后將提取的噬菌體10μl梯度稀釋，均勻涂布在TYE板（含有100 mg·L－1氨芐霉素，1%葡萄糖）上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育過夜，選取1016·L－1噬菌體進(jìn)行次輪篩選。第2輪和第3輪的篩選步驟與第1輪相似，不同之處在于洗脫過程中分別采用含有0.3%PBST和0.5%PBST洗脫。

1.2.2 噬菌體ELISA 首先，將第3輪擴(kuò)增所收集的富集克隆接種在TYE板（含100 mg·L－1氨芐霉素，1%葡萄糖）上，編號后挑選單克隆進(jìn)行擴(kuò)增。然后，將100μl濃度200 mg·L－1FN2-3肽段包被于ELISA板孔中，4℃過夜。后續(xù)過程參考 Lee等［5］方法進(jìn)行。使用Tecan全波長酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光度值，并提取吸光度值高于對照組的噬菌體DNA進(jìn)行測序、表達(dá)和純化。

1.2.3 結(jié)構(gòu)域抗體表達(dá)及純化 參考Lee等［5］方法進(jìn)行抗體擴(kuò)增。使用c-Myc標(biāo)簽蛋白純化試劑盒結(jié)純化構(gòu)域抗體。將500μl濾過后的上清加入純化柱中，隨后加入40μl抗c-Myc珠子，4℃緩慢顛倒孵育1 h，然后12 000×g離心10 s。之后加入200μl PBS4℃12 000×g離心 10 s洗脫非特異性結(jié)合，重復(fù)3次。向純化柱中加入40μl c-Myc洗脫肽，4℃孵育5 min，競爭性結(jié)合抗 c-Myc珠子，4℃下12 000×g離心10 s，收集離心管中的液體，為純化的單鏈抗體蛋白并分裝，于－20℃保存。

選用BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行單鏈抗體蛋白濃度測定。純化的單鏈抗體和BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白通過10%的SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色液染色、脫色后利用Image J軟件分析蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色的灰度值，根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白的灰度值，計(jì)算單鏈抗體的濃度。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測噬菌體－抗原結(jié)合及抗體－抗原結(jié)合 具體過程同噬菌體ELISA，僅將噬菌體改為200μg·L－1結(jié)構(gòu)域抗體。然后每孔加入100μl稀釋于3%BSA的兔抗c-Myc多克隆抗體的溶液（1∶1 000），室溫下孵育1 h；之后加入100μl稀釋于3%BSA的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫下孵育1 h。每次孵育后均使用0.1%PBST洗脫5 min×3次。TMB顯色10 min，之后加入50μl 1 mol·L－1硫酸終止顯色反應(yīng)，并使用Tecan全波長酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) SK-N-SH細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于75 cm2培養(yǎng)皿，DMEM-F12低糖培養(yǎng)液含10%胎牛血清，50 U·L－1青霉素／鏈霉素；溫度37℃，5%CO2。

1.2.6 免疫熒光染色檢測抗體與內(nèi)源性L1結(jié)合SK-N-SH細(xì)胞（2×104／孔）接種于8孔 Lab-Tek細(xì)胞小室中，培養(yǎng)48 h后使用4%多聚甲醛固定15 min，PBS輕洗5 min。10%驢血清室溫封閉 60 min，然后加入小鼠抗L1（1∶200）及H2-1抗體（200 μg·L－1）混合液4℃孵育過夜。之后加入兔抗c-Myc抗體（1∶200）室溫孵育2 h。上述過程結(jié)束后，加入驢抗小鼠 DylightTM（488）和驢抗兔 DylightTM（594）二抗（1∶500）混合液，室溫孵育2 h。每次孵育過程結(jié)束后均使用PBS洗滌5 min×3次?？篃晒馑p封片液封片，激光共聚焦顯微鏡 （FV-1000，Olympus公司）下觀察并采集圖像。

1.2.7 H2-1結(jié)構(gòu)域抗體對L1信號通路激活的影響 SK-N-SH細(xì)胞（5×104／孔）過夜培養(yǎng)于48孔板中，待細(xì)胞充分貼壁后，棄去常規(guī)培養(yǎng)液，分別加入新鮮培養(yǎng)液，并分別給予溶劑對照0及50μg·L－1H2-1抗體，作用48 h后裂解細(xì)胞，行Western blot檢測。

1.2.8 Western blot 約30μg細(xì)胞裂解液95℃變性10 min，加樣電泳，積層膠（5%）中恒壓80V，進(jìn)入分離膠（10%）后改恒壓150 V。采用濕轉(zhuǎn)法300 mA轉(zhuǎn)膜3 h，以5%BSA室溫封閉1 h，之后分別加入小鼠抗Erk及pErk1／2抗體（均為1∶1 000），以及小鼠抗Akt1及pAkt1抗體（均為1∶500）、小鼠抗GAPDH抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。之后用HRP標(biāo)記驢抗小鼠二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h。每次孵育結(jié)束后以TBST洗滌5 min×3次。使用超敏發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)水平，凝膠圖像分析儀（Multi-imageⅢ，Alpha Innotech公司）采集化學(xué)發(fā)光信號。

1.2.9 H2-1抗體對SK-N-SH細(xì)胞神經(jīng)突生長及細(xì)胞聚集的影響 SK-N-SH細(xì)胞（2×104／孔）接種于8孔Lab-Tek細(xì)胞小室中，培養(yǎng)過夜后棄除培養(yǎng)液，分別加入溶劑對照0及50μg·L－1抗體，48 h后使用4%多聚甲醛固定15 min，PBS輕洗5 min。之后行0.1%結(jié)晶紫4℃染色過夜。PBS輕洗5 min×3次，室溫下干燥后于200倍倒置顯微鏡下觀察并拍攝神經(jīng)突生長及細(xì)胞聚集情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用ˉx±s表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異。

Fig 1 Phage ELISA for the identification of positive clones and purification and concentration determination of H2-1 antibody

2 結(jié)果

2.1 陽性克隆篩選及噬菌體抗體表達(dá)及純化 經(jīng)3輪淘選后于TYE平板上隨機(jī)挑取24個克隆，并經(jīng)噬菌體ELISA檢測后，確定陽性克隆8個，分別命名為H2-1至H2-8，其中成功地對H2-1及H2-1噬菌體DNA進(jìn)行了測序。將噬菌體H2-1及H2-1轉(zhuǎn)染至大腸桿菌HB2151，經(jīng)表達(dá)純化后，僅獲得H2-1克隆所表達(dá)的抗體，其濃度為200μg·L－1。Fig 1A～C示。

2．2 結(jié)構(gòu)域抗體與抗原結(jié)合力及與內(nèi)源性L1結(jié)合檢測 ELISA結(jié)果顯示抗體H2-1與抗原多肽的結(jié)合力是對照組4倍，提示結(jié)構(gòu)域抗體自身可與抗原結(jié)合。免疫熒光顯示，SK-N-SH細(xì)胞L1成點(diǎn)狀排布于細(xì)胞膜表面，抗體標(biāo)簽c-Myc信號與L1信號有較好的重合，提示H2-1抗體與細(xì)胞內(nèi)源性L1結(jié)合良好，為后續(xù)信號通路及動物實(shí)驗(yàn)性治療研究提供了重要依據(jù)。Fig 2A～B示。

2．3 結(jié)構(gòu)域抗體對L1信號通路的影響 給予H2-1抗體24 h可明顯促進(jìn)Erk及Akt1磷酸化，磷酸化水平分別為對照組的17.44±5.66和1.84±0.49倍（與對照組相比，分別為P＜0.01和P＜0.05），提示該抗體可同時激活Erk及Akt1這兩條與L1功能密切相關(guān)的信號通路。Fig 3A示。

2．4 結(jié)構(gòu)域抗體對SK-N-SH細(xì)胞聚集的影響 與對照組及溶劑對照組相比，給予SK-N-SH細(xì)胞H2-1抗體50μg·L－148 h可明顯促進(jìn)SK-N-SH細(xì)胞神經(jīng)突生長及胞體聚集。Fig 3B示。

3 討論

L1是免疫球蛋白超家族成員，研究證明神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1可以同親和（自身結(jié)合）或異親和（與其他分子作用）方式對抗損傷后修復(fù)抑制分子，促進(jìn)軸突外生，從而有助于神經(jīng)再生［6－9］。噬菌體展示技術(shù)已成為結(jié)合肽、模擬肽以及拮抗型抗體篩選的重要工具［10］。本研究利用噬菌體展示技術(shù)成功篩選出可特異性結(jié)合細(xì)胞黏附分子L1 FN2-3區(qū)的激動型抗體，促進(jìn)L1下游信號分子Erk及Akt1磷酸化激活，并促進(jìn)神經(jīng)來源SK-N-SH細(xì)胞神經(jīng)突生長及細(xì)胞聚集。

Fig 2 Affinity evaluation of H2-1 antibody to FNⅡ-Ⅲ domain through ELISA and immunofluorescence

Fig 3 Effects of H2-1 antibody on L1 related cell signaling and cell accumulation in SK-N-SH cells

超表達(dá)L1的干細(xì)胞或施旺細(xì)胞、表達(dá)L1的腺相關(guān)病毒以及融合人免疫球蛋白Fc段的L1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（ECD-Fc）的應(yīng)用可在急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中增強(qiáng)神經(jīng)元再生、促進(jìn)成年大鼠挫傷性脊髓損傷后運(yùn)動系統(tǒng)的康復(fù)［7］。本研究篩選的激動型L1抗體H2-1的促神經(jīng)突生長及細(xì)胞聚集作用，可能系通過與L1 FN2-3區(qū)特異性結(jié)合，改變該區(qū)域構(gòu)象，易化L1與同一細(xì)胞鄰近分子或相鄰細(xì)胞上的分子發(fā)生同親和或異親和作用實(shí)現(xiàn)的（Fig 4）。L1激動型抗體克服了L1 ECD-Fc分子質(zhì)量大、難以大量生產(chǎn)和應(yīng)用的缺點(diǎn)。以往研究通過傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)獲得的小鼠抗體557.B6以及重組scFv片段G6-cys，可結(jié)合小鼠L1第2個和第3個纖連蛋白Ⅲ（FNIII）重復(fù)片段［3－4］，能以激動劑的形式刺激或觸發(fā)小鼠L1功能，因此對神經(jīng)生成以及神經(jīng)元存活發(fā)揮有益作用。但鼠源性抗體用于臨床治療，不可避免地存在異種排斥、效價降低等問題，本研究篩選的人源結(jié)構(gòu)域抗體分子質(zhì)量僅為scFv抗體的1／2（14 ku），具有分子質(zhì)量小、易于生產(chǎn)、更易穿過血－脊髓屏障等特點(diǎn)，具有更優(yōu)越的潛在臨床治療價值。

以上研究為深入了解激動型L1抗體治療脊髓損傷提供依據(jù)，為人源該抗體的應(yīng)用提供前瞻性的理論實(shí)證，并進(jìn)一步為其在脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)治療研究打下基礎(chǔ)。然而，如何提高抗體效價、防止在體實(shí)驗(yàn)中二聚體形成，以及L1激動型抗體如何與其他神經(jīng)損傷治療藥物聯(lián)合應(yīng)用是未來研究中需要解決的問題。

Fig 4 Schematic diagram showing the activation of potential H2-1 antibody-activated signaling pathway，which may contribute to enhanced L1 functions，including neurite outgrowth and cell accumulation.

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