表達白介素-23基因的重組純化及其對妊娠期哮喘氣道炎癥狀態(tài)下免疫應答產(chǎn)生的影響

馬佳佳，Nick Lu，陳必良

（1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710032；2.Department of Allergy-immunology，Northwestern University，USA Chicago 60611）

妊娠合并哮喘是妊娠合并癥中一種炎癥潛伏與反復發(fā)作免疫應答過程尚未明確的常見疾?。?］。由于妊娠期母體特有的生理狀態(tài)和炎癥的持續(xù)感染反復遷延，引發(fā)免疫應答異常導致的孕期并發(fā)癥，表現(xiàn)為肺組織病理損傷、胎兒低出生體重、早產(chǎn)危險性［2］等，均對母嬰安全和機體免疫系統(tǒng)的自身穩(wěn)定產(chǎn)生影響。白細胞介素-23（interleukin-23，IL-23）具有前炎癥反應活性［3］，通過結(jié)合靶細胞膜上IL-23受體，依賴致病CD4＋T細胞亞群，廣泛參與體內(nèi)免疫過程，調(diào)節(jié)免疫細胞分化，刺激并特異性促進相關(guān)因子表達［4］，因在多種肺部疾病炎癥形成以及靶組織病理生理反應中的作用而成為近年來的研究熱點［5］。本研究利用大腸桿菌表達的 IL-23重組蛋白，通過轉(zhuǎn)導細胞聚集定位和體外轉(zhuǎn)移鑒定，探討IL-23-IL-23R-IL-17炎性通路激活及其Th細胞線性家族平衡偏移特異性靶分子參與妊娠期哮喘發(fā)病的可能機制，為以IL-23為靶向，尋找針對其引發(fā)炎癥反應臨床免疫干預治療的新策略提供新思路。

1 材料

1.1 主要試劑 pMD18-T、pCEP4、E.coilDH5a、BL21（DE3）、肥大細胞株P(guān)815均由美國芝加哥西北大學過敏和免疫學系Nick Lu博士饋贈；pEGFPN1質(zhì)粒（美國 Invitrogen）；T4 DNA連接酶（大連TaKaRa）；限制性內(nèi)切酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiongalactopyranoside，IPTG）（美國 Amresco）；Glutathione Sepharose 4B（美國 Pharmacia Biotech）；凝膠電泳遷移率變動（EMSA）試劑盒（美國 Pierce）；熒光標記抗 FITC-CD4、CD25，抗PE-IFN-γ、IL-4、IL-17A，抗 PE-Cy5-FoxP3 mAb及同型對照（美國 BD／Pharmingen）；小鼠 IL-17A ELISA檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 動物與標本 SPF級♀ BALB／c小鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g／只（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供）；妊娠期哮喘婦女清晨空腹外周血采自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科就診自愿者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會討論通過。

2 方法

2．1 目的基因擴增及p40＋p19雙亞基表達載體構(gòu)建 根據(jù)GeneBank中IL-23 cDNA序列和p40／p19 mRNA參考序列設計引物，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務公司合成。p19F：5′-GAGCACCGGTCGCACCAGCAACCCTGAGTCCCTA-3′（下劃線為KpnⅠ酶切位點，雙下劃線為表達增強序列），p19R：5′-CAAAGCTCGAGTTCCCTTCCCATCTAATA A-3′（下 劃 線為 XhoⅠ 酶 切位 點）；p40F：5′-GCTAGTCGATGGTGAGCCGTGAT-3′（下劃線為NotⅠ 酶 切 位 點 ），p40R：5′-CATGACCGGCTAATGAGAAAGGGATT-3′（下劃線為KpnⅠ酶切位點，雙下劃線為表達增強序列）。

以 p19F／p19R、p40F／p40R為引物 PCR擴增IL-23基因p19和p40雙亞基cDNA全長。反應條件：94℃預變性 5 min；94℃30 s、61℃30 s、72℃1 min，30個循環(huán)后72℃延伸10 min。凝膠電泳鑒定并以兩者擴增產(chǎn)物為模板，p19F／p40R為引物完成重疊PCR擴增，反應條件同上。將純化產(chǎn)物分別克隆于pMD18-T載體，PmeⅠ酶切pMD18-T-p19／p40 DNA凝膠回收片段先后插入pCEP4載體，T4連接酶過夜連接后經(jīng)轉(zhuǎn)化、鋪板篩選、挑取克隆菌落擴增并提取質(zhì)粒，Pac I酶切和測序鑒定最終獲得重組pCEP4-IL-23（p19＋p40）命名為 pCEP4-IL-23。

2.2 重組蛋白誘導表達及產(chǎn)物純化鑒定 挑取重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coilBL21單菌落，于卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中220 r·min－1，37℃振搖過夜，至菌液波長A600nm值為0.5～0.6時，取1 ml菌液作為誘導前對照，剩余菌液中加入IPTG終濃度0.5 mmol·L－122℃誘導表達4 h，離心收集超聲裂解菌體上清0.22μm濾膜過濾，與預包被GST蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝膠顆粒4℃反應過夜，3次重復上樣。以預冷PBS洗脫未結(jié)合蛋白15 min×4次，收集梯度透析復性過濾產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡鑒定。

2.3 重組蛋白介導轉(zhuǎn)染及結(jié)合效應檢測 對數(shù)生長期P815細胞以1×106／孔接種24孔板，37℃培養(yǎng)過夜至細胞豐度達80%～90%。轉(zhuǎn)染前1 h吸去培養(yǎng)液，用5%葡萄糖和去離子水分別溶解純化的重組蛋白與pEGFP-N1質(zhì)粒，調(diào)濃度0.2 g·L－1。蛋白／質(zhì)粒按 0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0不同質(zhì)量比輕柔混均反應24 h，37℃水浴后將收集的蛋白／DNA復合液瞬時轉(zhuǎn)入實驗細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每一質(zhì)量比設3個平行孔。12 h后加入1 mg·L－1LPS，設LPS刺激前為0 d。分別于轉(zhuǎn)染后d 2、d 3、d 4熒光顯微鏡觀察并收集圖像。提取細胞總蛋白以anti-GST抗體檢測目的蛋白表達；比較兩者EMSA反應按試劑盒說明書操作進行，以單純pEGFP-N1質(zhì)粒與細胞共培養(yǎng)作為對照。

2.4 重組蛋白生物學功能檢測

2.4.1 體內(nèi)表達檢測 妊娠哮喘小鼠模型制備參照文獻［6］的方法完成并隨機分為4組。以尾靜脈快速注射方式，按預實驗確定的方案，單純模型組（A組）注入50μl生理鹽水；LPS組（B組）注入1 mg·L－1LPS；空載蛋白＋LPS組（C組）和純化重組蛋白＋LPS組（D組）分別注入 50μl GST／pCEP4和GST／pCEP4-IL-23后再給予 1 mg·L－1LPS刺激。分別于注射后d 2、d 4、d 7、d 14和d 21行小鼠眼眶靜脈叢取血（n＝6），血清IL-17A含量測定按ELISA試劑盒說明書進行；7 d時切取小鼠肺組織（n＝6）4%多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片（4～6μm）、常規(guī)HE染色后光鏡觀察并拍照。

2.4.2 體外表達檢測 完全RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮Ficoll法分離獲得的患者外周血單個核細胞（2×106·L－1），置于預包被 CD3 mAb 24孔板與 20μg·L－1佛波酯、10μg·L－1離子霉素混均 37℃孵育 6 h，實驗組加入純化重組蛋白或空載蛋白4℃條件共培養(yǎng)5 d，對照細胞不做任何處理。按試劑說明每孔先后加入飽和濃度的 FITC-CD4、CD25，PE-IFN-γ、IL-4、IL-17A和PE-Cy5-Foxp3抗體及同型對照，4℃避光反應30 min，PBS／多聚甲醛重懸細胞后進行流式細胞術(shù)（FCM）檢測，以上步驟重復3次。

2.5 統(tǒng)計學分析 重復實驗獲得的數(shù)據(jù)以ˉx±s表示并使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；兩組間樣本均數(shù)比較采用LSD-t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 重組穿梭載體構(gòu)建與鑒定 p19和p40重組克隆的PCR擴增產(chǎn)物大小為250 bp，均與預期cDNA相符。兩者先后插入pMD18-T載體并在分子量約240 bp（p19）和 240 bp（p40）處產(chǎn)生的清晰特異條帶與p19和p40亞基DNA長度吻合（Fig 1）。

Fig 1 Cloning the target gene and enzyme digestion of the shuttle plasmid

3.2 重組真核雙表達載體構(gòu)建與鑒定 將p19和p40全長基因混合后與pCEP4載體連接，經(jīng)重疊PCR及酶切鑒定，連接成功的陽性克隆能夠釋放大小約250 bp（p40＋p19）片段（Fig 2），測序結(jié)果表明重組真核表達質(zhì)粒中插入的目的基因序列無突變。

3.3 重組蛋白的表達和純化 經(jīng)IPTG誘導表達，含有重組質(zhì)粒的菌液粗蛋白可溶性較好，GST／pCEP4-IL-23表達的分子質(zhì)量在約36 000出現(xiàn)的顯影條帶與預期分子理論值相符（Fig 3A），層析純度達95%以上；其表達產(chǎn)物與GST發(fā)生的特異性結(jié)合反應，對應了96 ku處濃重清晰顯色條帶的分子質(zhì)量大?。‵ig 3B），未誘導對照及GST／pCEP4顯色較弱，可用于后續(xù)實驗。

Fig 2 PCR identification of recombinant expression plasmid of cloning

Fig 3 Genetically engineered bacteria and protein chromatography induced effects

3．4 重組蛋白轉(zhuǎn)導活性及DNA競爭結(jié)合遷移變化 顯微鏡下觀察到重組蛋白能夠?qū)①|(zhì)粒DNA高效攜入靶細胞。LPS刺激前EGFP基因以彌散狀態(tài)分布，刺激后隨時間的延長，EGFP表達形成多個熒光聚集且強度增高明顯（Fig 4A）；Western blot顯示分子質(zhì)量約96 ku的蛋白條帶 （Fig 4B），單純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞LPS刺激前后EGFP及蛋白表達均未見明顯變化。

EMSA顯示，LPS刺激指示出轉(zhuǎn)染細胞核蛋白的DNA結(jié)合活性隨蛋白／質(zhì)粒相對質(zhì)量比的增加而明顯變化。核蛋白提取物中的大分子復合體含量越高，其顯影位置凝膠遷移速率越低，區(qū)帶電泳滯后可將質(zhì)粒DNA完全阻滯于加樣孔中，表明蛋白中和DNA兩者的結(jié)合是特異的；單純質(zhì)粒的DNA結(jié)合活性很弱，由于不能與標記探針競爭抑制核蛋白，而呈現(xiàn)清晰的顯影條帶（Fig 5）。

Fig 4 Expression validation of cell activity after gene transfection

Fig 5 Electrophoretic mobility shift assay

3.5 重組蛋白的體內(nèi)持續(xù)表達對局部炎性改變影響 D組注射4～6 d后血清中IL-17A含量明顯高于A、B、C 3組，之后開始回落且逐漸穩(wěn)定，至21 d時幾乎為0（P＜0.05，F(xiàn)ig 6）；其肺組織炎性細胞浸潤、肺泡間隔擴大、粘膜上皮增生等過度炎癥損傷最為明顯。B、C組血清IL-17A水平及肺組織炎性病理改變明顯小于D組但強于A組（Fig 7）。

3．6 重組蛋白體外誘導對T細胞亞群分布及比例變化影響 與未經(jīng)處理的對照細胞相比較，GST／pCEP4-IL-23組除 IFN-γ、FoxP3細胞數(shù)下降，IL-4細胞數(shù)以及 Th2／Th1比例升高外，IL-17A細胞和Th17／Treg比例亦明顯增多、增高（P＜0.05，F(xiàn)ig 8）；GST／pCEP4組與對照細胞間的差異無顯著性。

Fig 6 Detection of IL-17A level in serum by ELISA analysis（n＝6，ng·L－1，ˉx±s）

Fig 7 Morphology of lung tissue in different mice groups（HE ×100）

4 討論

長期以來的觀點認為，支氣管哮喘發(fā)病過程中最重要的免疫異常是Th1／Th2相互拮抗和自身促進的平衡狀態(tài)被打破。然而，Th1／Th2失衡學說這一模式化理論并不能解釋哮喘免疫學基礎與臨床研究中的全部現(xiàn)象［7］。隨著哮喘發(fā)病機制研究的深入以及免疫、分子生物學的發(fā)展，一種新的假說，即炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展可能是T輔助細胞反應從Th2、Treg向Th17或者Th1偏移所引起；而阻斷關(guān)鍵性細胞因子可使免疫反應從Th17／Th1表型向 Treg和 Th2轉(zhuǎn)換［8］。近來研究［5］證實，Th17的上游調(diào)控因子IL-23是具有與IL-12功能相似但更為有效、復雜的效應分子。通過趨化炎癥細胞聚集與遷移，導致T細胞反應擴增以及過表達產(chǎn)生的IL-23／IL-17式瀑布效應等，均可造成母體多組織炎癥損害、矮小綜合癥、不育和（或）早產(chǎn)死亡［1］。而這一現(xiàn)象能夠解釋在發(fā)現(xiàn)Th17前的某些自身免疫性疾病模型中出現(xiàn)的理論偏差現(xiàn)象。

IL-23的免疫調(diào)控機制十分復雜，其異源二聚體產(chǎn)生以及生物學作用的發(fā)揮需要編碼p40和p19兩種亞基的同時表達［3］。為此，本研究首先采用基因分子拼接技術(shù)通過連接肽基因，成功擴增并將p40／p19亞基片段融合拼接在pCEP4載體上；預期編碼抗原基因IL-23的重組蛋白表達純化后，可穿透胞膜將外源質(zhì)粒攜入細胞并轉(zhuǎn)位于胞核，在相關(guān)DNA結(jié)合位點上形成穩(wěn)定復合體，通過大分子轉(zhuǎn)運以及調(diào)節(jié)炎癥反應過程來抑制核蛋白的遷移。上述結(jié)果確證作者選擇載體的多克隆位點不僅便于目的基因的插入，蛋白介導基因跨膜轉(zhuǎn)運直接或間接的功能作用，實現(xiàn)EGFP基因的穩(wěn)定表達，增加外源物質(zhì)的DNA結(jié)合活性，為探討重組蛋白免疫功能對IL-23基因表達影響，從細胞轉(zhuǎn)錄水平闡明其與妊娠哮喘抗感染免疫的可能機制奠定實驗基礎，也為生物大分子藥物進入組織細胞內(nèi)發(fā)揮治療作用提供新的思路。

Fig 8 Evaluation of recombinant protein in vitro by FCM（ˉx±s，n＝6）

在闡明IL-23／IL-17為主軸的免疫調(diào)節(jié)途徑與妊娠期哮喘發(fā)病的可能作用及機制方面，實驗制作妊娠哮喘小鼠模型，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)導活性檢測發(fā)現(xiàn)所表達的重組蛋白表現(xiàn)出比對照蛋白更高的活性，經(jīng)尾靜脈注射14 d后小鼠血清中仍可觀察到IL-17A的存在，由此產(chǎn)生免疫網(wǎng)絡調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能紊亂引發(fā)肺組織病理損傷改變增多等，可能是外源性蛋白激活I(lǐng)L-23R信號位點并有效在宿主染色體上整合而不易被降解清除，導致Th17分化增強和IL-17表達增多。除此之外實驗進一步觀察發(fā)現(xiàn)，增加小劑量的LPS，使刺激升高的IL-23R磷酸化水平通過增強p19／p40亞基轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)了IL-23基因病理性表達［9］，而空載蛋白即使增加LPS及單純LPS誘導，均未能達到相同效果。筆者認為，活化IL-23啟動的炎癥通路導致免疫平衡向Th17偏移具有一定的相關(guān)性。在一定程度上加劇了炎癥細胞的浸潤與黏附，改變了妊娠哮喘孕婦的局部微環(huán)境，是導致母體慢性炎癥反復發(fā)生的關(guān)鍵所在。筆者的研究表明細胞反應的調(diào)節(jié)是可誘導的［10］；IL-23-IL-23R-Th17-IL-17炎癥軸在妊娠哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中存在功能改變，破壞了妊娠哮喘母體自身組織和抗原的免疫耐受，證實其活化和優(yōu)勢應答可致妊娠期哮喘發(fā)病這一機制。

本研究體外細胞實驗測定IL-23促炎癥效應發(fā)現(xiàn)，患者外周血中除存在Th2／Th1失平衡外，還同時存在Th17表達增高和Treg數(shù)量減少，提示純化重組蛋白發(fā)揮的免疫干擾特性抑制Th1、Treg細胞復制，促進Th2、Th17細胞生成。由此推測，Th1反應向Th2反應轉(zhuǎn)化與Th17／Treg比值升高變化共同參與妊娠期哮喘異常免疫反應調(diào)解，使母體和胎兒自體反應性CD4＋T細胞抑制功能降低［11］和（或）呈低反應性；激活的相關(guān)致炎因子以過度釋放方式造成炎癥損傷擴大并持久存在，增加妊娠哮喘母體對病毒的易感性［12］，促發(fā)孕婦罹患哮喘的幾率，加重感染后疾病的嚴重程度；而免疫功能亢進和免疫應答失平衡的雙向性變化，最終導致妊娠期哮喘的多種并發(fā)癥。作者的研究結(jié)果及觀點進一步證實CD4＋T細胞不同亞群在分化過程中和功能上存在相互抑制，支持Th1／Th2／Th17／Treg細胞線性家族間精細而復雜的平衡狀態(tài)決定疾病形成和進展的發(fā)現(xiàn)。

總之，闡明IL-23與其他免疫細胞亞群之間平衡的調(diào)節(jié)機制以及對機體免疫狀態(tài)的影響，對于改善甚至逆轉(zhuǎn)妊娠哮喘慢性氣道炎癥反應的藥物開發(fā)和探索新的治療靶點具有重要意義。

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