槲皮素對H2 O2損傷PC12細胞的保護效果與機制

劉紅亮，胡 磊，王靖凱，劉 彬，李金菊，鄧錦波

（河南大學1.藥學院神經(jīng)生物學研究所、2.護理學院，河南 開封 475004）

細胞內氧化與抗氧化之間的平衡對細胞的生存至關重要，氧化應激水平的提高能夠損傷細胞甚至導致細胞死亡，氧化損傷是阿爾采末病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病以及艾滋病腦病重要的發(fā)病機制。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是細胞內氧化應激的重要因素之一，包括超氧離子、羥自由基等［1］。ROS通過氧化損傷多種生物分子包括DNA、膜脂和蛋白質，導致細胞功能障礙，甚至誘導細胞凋亡或壞死［2－3］。SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶能夠清除氧自由基，保護并修復氧化損傷的細胞［4］。

黃酮類化合物具有多種生物活性，包括對神經(jīng)元發(fā)揮類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護作用［5－6］。槲皮素（quercetin）是一種廣泛存在于中草藥和蔬果中的天然黃酮類化合物，研究證明其具有抗癌、抗炎等作用［7］，還可通過調節(jié)胞內信號分子保護細胞免受氧化應激損傷［8－9］。本研究利用H2O2誘導類神經(jīng)細胞系PC12凋亡建立模型，檢測槲皮素對PC12細胞的保護作用并初步分析其作用機制，為深入研究其在神經(jīng)退行性疾病臨床治療上應用的可行性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞（PC12細胞）購自中國科學院上海細胞所。槲皮素購自阿拉丁試劑公司（用DMSO配制成濃度為100 mmol·L－1儲備液）。高糖DMEM干粉培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胰蛋白酶購自北京鼎國生物科技有限公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。多聚賴氨酸購自美國Sigma公司。H2O2溶液（分析純）購自無錫市蘇強化工有限公司。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定試劑盒、丙二醛（malondialdelyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。Hoechst 33342購于美國Sigma公司。TUNEL檢測試劑盒購于美國 Promega公司。2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購自美國Sigma公司。高內涵活細胞成像系統(tǒng)（high content screening，HCS）購置美國TFS公司。奧林巴斯顯微成像系統(tǒng)購于日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞的培養(yǎng) PC12細胞接種到含有胎牛血清（體積比 10∶1）、100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的高糖 DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，常規(guī)胰蛋白酶消化傳代，備用。

1.2.2 槲皮素對PC12細胞增殖的影響 采用MTT檢測槲皮素對PC12細胞增殖的影響，取對數(shù)生長期的PC12細胞以5×107個·L－1的細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細胞懸液。24 h后，加入100μl的槲皮素溶液，使其終濃度分別為 2 000、1 000、500、250、125、62.5μmol·L－1。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入5 g·L－1的 MTT，37℃孵育4 h，再加入150μl DMSO。振蕩10 min使結晶甲臜充分溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長下檢測OD值。實驗重復3次，細胞活力／%＝（實驗組平均值／對照組平均值）×100%。

1.2.3 MTT檢測槲皮素對PC12細胞的保護 取對數(shù)生長期的PC12細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，24h后用于實驗。實驗分為7組：空白對照組、對照組、H2O2損傷組（500μmol·L－1）、槲皮素保護組（500、250、125、62.5μmol·L－1）。首先在保護組中加入槲皮素溶液，使其終濃度達到相應值，2 h后再加入500μmol·L－1H2O2。24 h后，加入 5 g·L－1的MTT，4 h后終止培養(yǎng)，小心地吸棄上清培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10 min后，采用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處檢測OD值，實驗重復3次。細胞活力／%＝（實驗組－空白組）／（對照組－空白組）×100%。

1.2.4 LDH法檢測槲皮素對PC12細胞的保護細胞在損傷過程，細胞內的LDH會釋放到培養(yǎng)基中，而活細胞無此功能，所以培養(yǎng)上清中LDH的含量反映細胞的死亡或損傷程度。各組細胞經(jīng)相應處理后，吸取細胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書操作檢測LDH含量。

1.2.5 TUNEL法觀察細胞凋亡情況 將對數(shù)生長期的PC12細胞接種于放有蓋玻片的6孔板中。用PC12細胞為對照，用 H2O2損傷建立模型，以500 μmol·L－1的槲皮素作為保護組，細胞經(jīng)相應處理過后，按照TUNEL檢測試劑盒提供的操作說明書進行凋亡檢測。在熒光顯微鏡下進行顯微成像觀察并拍照，實驗重復3次。

1.2.6 PC12細胞內ROS和MDA含量測定 取對數(shù)生長期的PC12細胞以5×107個·L－1的細胞濃度接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的96孔細胞培養(yǎng)板中，分設對照組和模型組，用500μmol·L－1的槲皮素處理作為保護組，細胞經(jīng)上述處理后，吸棄上清培養(yǎng)液，用 0.01 mol·L－1的 PBS洗3次，加入 1 mg·L－1的Hoechst 33342避光染色30 min后，再加入10 μmol·L－1的 DCFH-DA溶液繼續(xù)染色 30 min。經(jīng)0.01 mol·L－1的PBS洗3次后，采用高內涵活細胞成像系統(tǒng)（HCS）在激發(fā)光為485 nm和發(fā)射光為525 nm的條件下檢測熒光值。另用6孔板培養(yǎng)PC12細胞，如前所述，分設對照組、模型組和藥物保護組，細胞經(jīng)處理后收集，超聲破碎后按照MDA檢測試劑盒說明書操作，在530 nm波長下檢測OD值并計算其含量，實驗重復3次。

1.2.7 PC12細胞內SOD、CAT和GSH-PX含量測定 6孔板培養(yǎng)PC12細胞，分設對照組和模型組，用500μmol·L－1的槲皮素作為保護組。細胞經(jīng)相應處理后收集，超聲細胞破碎后離心，吸取上清100 μl分別在 550、240、412 nm波長下按照 SOD、CAT、GSH-PX檢測試劑盒說明書操作測定OD值，并計算其活力，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，并對MTT、LDH、SOD、CAT和 GSH-PX等檢測結果均采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗，用ˉx±s表示。

2 結果

2．1 槲皮素對PC12細胞增殖的影響 Fig 1為槲皮素對 PC12細胞增殖的影響。由圖可以看出，PC12細胞在不同濃度的槲皮素作用下，細胞增殖稍有變化，但與對照組相比無統(tǒng)計學意義，由此說明槲皮素對PC12細胞增殖沒有影響。

Fig 1 Effect of quercetin on proliferation of PC12 cells（ˉx±s，n＝3）

2．2 MTT檢測槲皮素對PC12細胞的保護 MTT實驗檢測槲皮素對PC12的保護效果，結果如Fig 2所示。與對照組比較，模型組的細胞存活率明顯降低（P＜0.01），經(jīng)槲皮素保護后細胞存活率明顯增加（P＜0.01，P＜0.05）。

2．3 LDH檢測槲皮素對PC12細胞的保護 對照組、模型組和藥物保護組培養(yǎng)液中LDH的含量檢測結果如Fig 3所示：對照組中的LDH含量較低，而模型組中的LDH含量比較高（P＜0.01）；經(jīng)槲皮素保護后，LDH含量下降，并隨槲皮素濃度的增加而逐漸減少（P＜0.01，P＜0.05），表明槲皮素有效降低H2O2對PC12細胞的氧化損傷，且保護效果與槲皮素濃度呈正相關。

Fig 2 Protective effect of quercetin on PC12 cells viability rate induced by H 2 O2（ˉx±s，n＝3）

Fig 3 Protective effect of quercetin on PC12 cells death rate induced by H2 O2（ˉx±s，n＝3）

2．4 TUNEL法觀察細胞凋亡情況 在顯微鏡下觀察槲皮素保護PC12細胞抗氧化效果的形態(tài)學變化，如Fig 4所示。經(jīng)TUNEL法檢測后任選3個視野進行細胞統(tǒng)計，模型組中與對照組相比，經(jīng)500 μmol·L－1H2O2誘導PC12細胞凋亡情況明顯增加（P＜0.01，P＜0.05）；然而與模型組比較，經(jīng) 500 μmol·L－1槲皮素處理的保護組中凋亡細胞明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。

Fig 4 Protective effect of quercetin on apoptosis induced by H 2O2（tested by TUNEL）（40×，ˉx±s，n＝3）

2．5 PC12細胞內ROS和MDA含量的影響 槲皮素保護PC12細胞抵抗H2O2引起的氧化損傷中ROS和MDA的變化，如Tab 1所示：與對照組比較，模型組中的ROS的相對熒光強度（relative fluorescence unit，RFU）和 MDA含量均明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，保護組中的ROS的相對熒光強度和MDA含量均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。由此說明，槲皮素能夠降低細胞內的ROS和MDA的含量。

Tab 1 Effect of quercetin on ROS and MDA in PC12 cells induced by H 2 O2（ˉx±s，n＝3）

2．6 PC12細胞內SOD、CAT和 GSH-PX活力的影響 槲皮素對PC12細胞抗氧化中SOD、CAT和GSH-PX活力的影響如Tab 2所示。從表中可以看出，SOD、CAT和GSH-PX活力明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，SOD、CAT和 GSH-PX活力明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。由此說明，槲皮素能夠增加細胞內SOD、CAT和GSH-PX活力。

Tab 2 Effect of quercetin on CAT，SOD and GSH-PX in PC12 cells induced by H 2O2（ˉx±s，n＝3）

3 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，黃酮類化合物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中能夠緩解氧化應激引起的氧化損傷，可能對治療和預防神經(jīng)退行性?。∟D）發(fā)揮作用。國內外還少見槲皮素在ND中的應用研究，為此該課題利用槲皮素保護H2O2誘導PC12細胞引起的氧化損傷，初步探討了槲皮素保護PC12免受氧化損傷的效果與機制。

MTT實驗是檢測活細胞數(shù)量的常用方法，在不同濃度槲皮素保護PC12細胞免受H2O2損傷的實驗中，不同濃度的槲皮素明顯增加了PC12細胞的存活率，且具有濃度依賴性；當細胞胞膜損傷時，胞內的LDH會釋放到培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中LDH含量是檢測細胞死亡的一個重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2誘導PC12損傷的模型組細胞培養(yǎng)液中LDH水平明顯增加，而經(jīng)不同濃度槲皮素處理之后的保護組細胞培養(yǎng)液中LDH水平明顯減少，且存在濃度依賴性。另外，我們用MTT實驗還證明，槲皮素在不同濃度下對PC12細胞的存活率都沒有統(tǒng)計學意義，說明槲皮素對PC12細胞沒有明顯的毒性作用或促增殖作用，所以，以上實驗結果相互印證，充分說明槲皮素能夠有效保護PC12細胞免受H2O2的損傷。細胞死亡有不同形式，凋亡和壞死是細胞死亡的一般方式。TUNEL可以與斷裂的DNA片段的3′-OH結合，是檢測細胞凋亡的一種有效方法。我們用TUNEL標記分析槲皮素減少PC12細胞死亡的方式，結果證實槲皮素能夠降低H2O2誘導的PC12細胞凋亡，說明槲皮素通過減少PC12細胞凋亡產(chǎn)生保護效果。

ROS能夠使細胞膜上的脂類氧化，產(chǎn)生MDA，從而造成細胞損傷并引發(fā)凋亡，一些藥物或中藥成分如Va、Vc、Ve、生物黃酮類以及類胡蘿卜素等均具有清除自由基活性［10－12］。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理PC12細胞的模型組細胞內ROS的量明顯增加，MDA的量也相應上升，用槲皮素保護后，細胞內ROS的量明顯降低，MDA的量也明顯下降，說明槲皮素能夠降低H2O2處理對PC12細胞造成的損傷，這是槲皮素減少H2O2誘導PC12細胞凋亡的重要機制。SOD、CAT和GSH-PX均屬于內源性的抗氧化酶，能夠直接清除ROS，為了進一步研究槲皮素的抗氧化機制，我們檢測了槲皮素對細胞內SOD、CAT和GSH-PX活性的影響，結果說明H2O2處理使PC12細胞胞內SOD、CAT和GSH-PX活性降低，而用槲皮素保護可以明顯增加胞內SOD、CAT和GSH-PX活性。

本研究說明槲皮素能夠增加H2O2處理的PC12細胞內SOD、CAT和GSH-PX的活性，清除細胞內的ROS，從而減少ROS所誘導PC12細胞的凋亡，實現(xiàn)保護PC12細胞的效果。胞內氧化與抗氧化之間的平衡對細胞的存活和功能起著至關重要的作用，如果兩者失衡將會導致ROS大量產(chǎn)生，過量產(chǎn)生的ROS能夠誘導胞內相關信號通路發(fā)生改變，如基因調節(jié)、蛋白氧化損傷和脂質過氧化損傷等［13－14］。氧化應激造成神經(jīng)細胞損傷是許多神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要機制，如阿爾采末?。ˋD）、帕金森?。≒D）、癲癇和 X染色體易損綜合癥等［15－18］。槲皮素是廣泛存在于多種中藥的天然產(chǎn)物，其對H2O2誘導PC12類神經(jīng)細胞的保護預示著可能對一些神經(jīng)退行性疾病有一定療效，是一種重要的藥物前體分子。

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