表沒食子兒茶素沒食子酸酯全乙?；苌飳θ峒t霉素致小鼠心臟毒性的影響

李 麗，唐燕霞，歐冰凝，周煥第，陳潤麗，劉布鳴，梁 鋼

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；3.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022）

柔紅霉素（daunorubicin，DNR）是常用的蒽環(huán)類藥物之一，抗腫瘤活性廣泛。然而DNR具有心臟毒性，重者可致心力衰竭甚至死亡，使其臨床應(yīng)用受到了限制［1］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯［（－）－epigallocatechin-3-gallate，EGCG］是從茶葉中提取的一種茶多酚單體，在茶葉中含量高且生物活性較強(qiáng)。EGCG具有抗氧化、抗肝癌及抑制心肌細(xì)胞氧化損傷等廣泛的生物活性［2－4］。研究發(fā)現(xiàn)［5］，EGCG能有效抑制羰基還原酶（CBR1）的代謝活性，增強(qiáng)DNR抗腫瘤作用并降低其心臟毒性。但由于EGCG脂溶性差、體內(nèi)不穩(wěn)定以及生物利用度低等原因使其應(yīng)用受到了限制。EGCG乙?；苌锸窃贓GCG的側(cè)鏈酚羥基上進(jìn)行乙?；揎棲@得的，其穩(wěn)定性和生物利用度比EGCG高［6］。體外實(shí)驗(yàn)表明EGCG全乙?；苌铮ˋcEGCG）有較好的逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥性作用［7］；AcEGCG聯(lián)合5-FU的體內(nèi)抑瘤作用比 EGCG聯(lián)合5-FU的增強(qiáng)，且毒性降低［8］。本研究旨在通過制備柔紅霉素致小鼠心臟毒性模型，觀察AcEGCG對心電圖、心肌酶等生化指標(biāo)及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響，探討AcEGCG對心臟毒性的保護(hù)作用及初步作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠80只，清潔級，♀♂各半，體質(zhì)量（20±2）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK桂2009－0002。

1.1.2 藥物與試劑 柔紅霉素，Actavis Italy S.p.A.（批號 1F10111）。AcEGCG，純度 98.77%，本課題組自合成，臨用前用質(zhì)量濃度為5 g·L－1的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液制成混懸液。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒為上海執(zhí)誠生物科技股份有限公司產(chǎn)品；肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）、α-羥基丁酸脫氫酶（α-HBDH）試劑盒為德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司產(chǎn)品。高敏肌鈣蛋白 T（TNT-Hs）檢測試劑盒為羅氏公司產(chǎn)品。SOD、MDA及蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；7600-020 Automatic Analyzer（HITACHI）；羅氏 Cobas 6000；H-7650型透射電鏡（日本日立）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟毒性模型的制備及給藥方法 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，檢測心電圖，取正常者隨機(jī)分為4組（每組 20只）：①正常對照組（Control）；②DNR模型組（Model）；③AcEGCG高劑量組（HAcEGCG）；④AcEGCG低劑量組（L-AcEGCG）。參考AcEGCG體內(nèi)抑瘤作用劑量［8］設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)給藥劑量，按 0.02 ml·g－1的灌胃（ig）體積計(jì)，AcEGCG高劑量組80mg·kg－1·d－1，AcEGCG低劑量組 40 mg·kg－1· d－1，正常對照組和模型組 ig給予質(zhì)量濃度為5 g·L－1的CMC-Na，連續(xù)給藥7 d。在末次ig給藥1 h后，除正常對照組腹腔注射（ip）等體積NS外，其余各組小鼠 ip DNR（15 mg·kg－1），制備DNR心臟毒性模型［9］。

1.2.2 心電圖觀察 注射DNR 48 h后，小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，采用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)描記心電圖，觀察心律失常的發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)各種類型的期前收縮、房室傳導(dǎo)阻滯、竇性心動(dòng)過速、竇性心動(dòng)過緩等之一者為心律失常陽性［10］。

1.2.3 標(biāo)本收集 描記心電圖后，小鼠摘眼球取血，制備血清。并立即處死動(dòng)物，取出心臟，用預(yù)冷NS沖洗，濾紙吸干后稱重，在冰浴中取心室部分，用NS制成10%心肌組織勻漿，4℃，3 000 r·min－1離心10 min后，取上清液檢測生化指標(biāo)。取心尖部米粒大小心肌用于電鏡觀察。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測 在全自動(dòng)生化分析儀上測定血清心肌酶（ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH）活性；采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清TNT-Hs含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測定心肌蛋白含量；采用試劑盒測定血清與心肌中SOD活性和MDA含量。

1.2.5 電鏡觀察 取心尖部米粒大小心肌，2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，丙酮脫水，樹脂包埋，超薄切片，1%醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩組樣本率比較采用Fisher′s確切概率法。

2 結(jié)果

2．1 AcEGCG對小鼠心電圖和血清TNT-Hs水平的影響 注射DNR 48 h后，模型組小鼠的心律失常發(fā)生率明顯高于正常對照組（P＜0.01），AcEGCG給藥組與模型組比較，心律失常發(fā)生率有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組小鼠血清TNTHs水平明顯高于正常對照組（P＜0.01）。與模型組比較，AcEGCG高、低劑量組小鼠血清TNT-Hs水平明顯降低（P＜0.01）（Tab 1）。

Tab 1 Effects of AcEGCG on electrocardiogram and levels of serum TNT-Hs in DNR-induced cardiotoxic mice

2．2 AcEGCG對小鼠血清心肌酶譜的影響 模型組小鼠血清心肌酶（ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH）活性均明顯高于正常對照組（P＜0.01）。與模型組比較，AcEGCG高、低劑量組小鼠血清心肌酶活性明顯降低（P＜0.01，P＜0．05）（Tab 2）。

2．3 AcEGCG對小鼠血清和心肌SOD活性和MDA含量的影響 模型組小鼠血清和心肌SOD活性明顯低于正常對照組（P＜0.01），MDA含量明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，AcEGCG高、低劑量組小鼠血清和心肌SOD活性明顯升高（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0．01，P＜0.05）（Tab 3）。

2．4 AcEGCG對小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 與正常組（Fig 1A）相比，模型組（Fig 1B）心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，心肌細(xì)胞腫脹，部分肌絲排列紊亂，出現(xiàn)斷裂溶解，線粒體腫脹明顯，線粒體嵴斷裂。AcEGCG低劑量組（Fig 1C）心肌纖維結(jié)構(gòu)基本正常，線粒體輕度腫脹，可見少數(shù)肌絲斷裂，個(gè)別線粒體嵴斷裂，心肌損傷比模型組明顯減輕。

Tab 2 Effects of AcEGCG on serum myocardial enzymes in DNR-induced cardiotoxic mice（ˉx±s）

Tab 3 Effects of AcEGCG on activities of SOD and content of MDA in serum and myocardium in DNR-induced cardiotoxic mice（ˉx±s）

Fig 1 Effects of AcEGCG on myocardial ultrastructure in DNR-induced cardiotoxic mice

3 討論

DNR等蒽環(huán)類藥物主要通過插入DNA雙鏈、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和細(xì)胞凋亡作用殺死腫瘤細(xì)胞。除了高效抗腫瘤作用，DNR對正常健康細(xì)胞尤其是心肌細(xì)胞有毒性作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，DNR在體內(nèi)被羰基還原酶1（CBR1）代謝為柔紅霉素醇，柔紅霉素醇不僅抗腫瘤活性比柔紅霉素低，還會造成心肌細(xì)胞損傷［12］。心肌細(xì)胞膜受損后，細(xì)胞內(nèi)的多種酶外漏，如乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CK）等，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能［13］。因此，血清心肌酶譜（ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH）是臨床上反映心肌損害的主要生化指標(biāo)。高敏肌鈣蛋白T（TNT-Hs）為心肌結(jié)構(gòu)蛋白，是心肌細(xì)胞損傷的一個(gè)高敏性標(biāo)志物，可檢出某些心肌酶譜不能檢出的微小損傷［14］。MDA作為膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，而SOD活性高低反映機(jī)體清除氧自由基的能力。

本實(shí)驗(yàn)給予小鼠腹腔注射 DNR（15 mg·kg－1），48 h后模型組小鼠心律失常發(fā)生率高達(dá)65%，血清心肌酶 ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH水平升高，TNT-Hs釋放增多，血清和心肌SOD活性降低，MDA含量升高，心肌超微結(jié)構(gòu)明顯損傷，DNR致小鼠心臟毒性模型復(fù)制成功。而預(yù)先給予AcEGCG的小鼠心律失常發(fā)生率有一定程度降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AcEGCG還抑制血清心肌酶 ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH活性，降低血清TNT-Hs水平，提高血清和心肌SOD活性，降低MDA含量。結(jié)果提示AcEGCG可以保護(hù)心肌細(xì)胞，拮抗DNR心臟毒性，其作用機(jī)制可能與提高心肌中抗氧化酶活性和清除自由基有關(guān)。電鏡下觀察，可見AcEGCG低劑量組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。AcEGCG作為EGCG的結(jié)構(gòu)修飾衍生物，化學(xué)穩(wěn)定性提高、脂溶性增強(qiáng)，生物利用度增加，進(jìn)入體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為EGCG，通過抑制CBR1活性，減少DNR代謝生成柔紅霉素醇，從而降低其心臟毒性［5－6］。由此我們設(shè)想，AcEGCG有望代替EGCG，用于腫瘤的防治，與DNR聯(lián)用，可能既預(yù)防或減輕DNR對心肌的損傷，又協(xié)同或增強(qiáng)DNR的抗腫瘤作用。研究結(jié)果將為開發(fā)新一代腫瘤防治藥物提供新思路，也將為EGCG衍生物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明［8］，AcEGCG 80 mg·kg－1單獨(dú)使用對腫瘤細(xì)胞殺傷力較弱，卻明顯增強(qiáng)5-FU的抗腫瘤作用，提示在發(fā)揮增效減毒作用時(shí)，AcEGCG所需劑量可能較小。因此，本實(shí)驗(yàn)以80 mg·kg－1作為高劑量，40 mg·kg－1作為低劑量。結(jié)果顯示，AcEGCG高、低劑量組作用無明顯差異，且低劑量組總體上略好于高劑量組。原因可能為80 mg·kg－1超出AcEGCG降低心臟毒性作用的量效關(guān)系范圍，其增效減毒的最佳劑量還需進(jìn)一步摸索。

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