低氧誘導(dǎo)因子-3α的研究進(jìn)展

鹿 輝，尹 強(qiáng)，王 榮，謝 華，李文斌，賈正平，張娟紅

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍高原損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州 730050）

低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible transcription factor，HIF）最早是由Semenza等［1］于1992年在研究促紅細(xì)胞生成素基因時發(fā)現(xiàn)的。HIF是細(xì)胞應(yīng)對氧氣水平降低時的主要調(diào)節(jié)因子，調(diào)控依賴氧氣水平相關(guān)基因的表達(dá)［2］。這些基因主要參與造血、血管生成、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、葡萄糖的利用、細(xì)胞外基質(zhì)的合成、細(xì)胞的增殖、生存及凋亡和腫瘤的發(fā)生等過程［3－4］。HIF是由一個不穩(wěn)定的 α亞基（HIF-α）和一個穩(wěn)定的β亞基（HIF-β）組成的二聚體，具有結(jié)合靶基因的低氧反應(yīng)元件（hypoxia response elements，HREs）的能力，從而發(fā)揮調(diào)控作用。HIF-α和HIF-β亞基均屬于 bHLH-PAS（bHLH，basic helix-loop-helix；PAS，Per-ARNT-Sim；Per，period circadian protein；ARNT，aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein；Sim，single-minded protein）蛋白家族的成員［5］。序列同源性HIF-α亞基在人體中目前認(rèn)為有3種：HIF-1α（由基因 HIF1A編碼）、HIF-2α（由基因 EPAS1編碼）和HIF-3α（由基因HIF3A編碼HIF-3α的多種剪接變異體）［6］，三者均受氧濃度調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)HIF活性的功能亞單位［8］。。相對于HIF-1α和HIF-2α，對HIF-3α的認(rèn)識和研究還比較匱乏。HIF-3α存在多種剪切變異體，其功能也不盡相同，調(diào)控包括低氧應(yīng)激在內(nèi)的多種生理活動。本綜述將系統(tǒng)地介紹HIF-3α的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控及其在多種生理活動中的調(diào)控作用。

1 HIF-3α的結(jié)構(gòu)

HIF-1α和HIF-2α亞基具有相似的結(jié)構(gòu)域，均具有1個N端bHLH結(jié)構(gòu)域，2個PAS結(jié)構(gòu)域，氧氣依賴降解結(jié)構(gòu)域（oxygen-dependent degradation domain，ODD）以及 N端和 C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transactivation domain，TAD）組成，N端的TAD結(jié)構(gòu)域的部分序列與ODD重疊［9］。1998年，在老鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了HIF-α的第3種亞型HIF-3α［10］，在人體內(nèi)于2001年首次發(fā)現(xiàn)HIF-3α［11］。這種新的蛋白與HIF-1α和HIF-2α的bHLH-PAS區(qū)域有55%的相似性［10］。與HIF-1α和HIF-2α相似，HIF-3α中也含有1個ODD結(jié)構(gòu)域和1個N-TAD結(jié)構(gòu)域，但沒有C-TAD結(jié)構(gòu)域（Fig 1）。

Fig 1 Structural alignment of human HIF-1α，HIF-2α and HIF-3αsubunits

2 人類 HIF-3α（hHIF-3α）的剪接變異體

人類HIF-3α（hHIF-3α）有8種剪接變異體，其結(jié)構(gòu)域見Fig 2，與鼠 HIF-3α（mHIF-3α）相似，人類 HIF-3α基因包含19個內(nèi)含子，長度大約是43 kb的堿基長度，位于染色體的19q13.2的位置。3個特別的外顯子1a、1b和1c很可能含有8種剪接變異體的轉(zhuǎn)錄起始位點。外顯子2編碼bHLH結(jié)構(gòu)域，外顯子3-9編碼PASa、PASb和PAC（PAS-associated C-terminal domain）結(jié)構(gòu)域，外顯子11的3′末端部分、整個的外顯子12和外顯子13的5′末端部分編碼ODD結(jié)構(gòu)域，外顯子14a和16編碼亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（leucinezipper，LZIP）［6］。

hHIF-3α1的序列從外顯子1c開始，到外顯子16終止。hHIF-3α1編碼668個氨基酸長度的蛋白質(zhì)，含有N-TAD結(jié)構(gòu)域，但并不含有C-TAD結(jié)構(gòu)域。有趣的是，與HIF-1α、HIF-2α及其他hHIF-3α的變異體不同的是，hHIF-3α1含有獨(dú)特的亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZIP）結(jié)構(gòu)域。LZIP結(jié)構(gòu)具有介導(dǎo)與DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的功能。hHIF-3α1的另外一個特殊的結(jié)構(gòu)是，在ODD和LZIP結(jié)構(gòu)域的上游具有LXXLL（Leu-Xaa-Xaa-Leu-Leu）基序。LXXLL基序主要在核受體的共因子中發(fā)現(xiàn)，是蛋白質(zhì)相互作用的位點。LZIP和LXXLL結(jié)構(gòu)在HIF-1α和HIF-2α中都不存在，表明hHIF-3α1可能具有結(jié)合啟動子序列的能力或者結(jié)合不被HIF-1α和HIF-2α識別的新蛋白質(zhì)的能力。hHIF-3α2從外顯子1a開始，終止于外顯子13a，不包含外顯子1b和1c，編碼632個氨基酸長度的蛋白質(zhì)。hHIF-3α2的結(jié)構(gòu)與hHIF-3α1非常相似，但缺少LZIP結(jié)構(gòu)域及其上游的LXXLL基序。hHIF-3α4從外顯子1a開始，終止于不完整的內(nèi)含子8，內(nèi)含子7沒有被剪切掉。編碼363個氨基酸長度的蛋白質(zhì)，只含有 bHLH、PASa和 PASb結(jié)構(gòu)域，缺少 N-TAD、CTAD、ODD和LZIP結(jié)構(gòu)域及LXXLL基序，表明hHIF-3α4可能作為hHIF調(diào)控系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子。hHIF-3α6從外顯子1b開始，缺少外顯子3和hHIF3α4相似，含有內(nèi)含子7并終止于內(nèi)含子8，hHIF-3α6蛋白只包含 C末端的結(jié)構(gòu)域PASb。hHIF-3α7和 hHIF-3α8結(jié)構(gòu)相似，但 hHIF-3α7缺少LZIP結(jié)構(gòu)域。hHIF-3α9和 hHIF-3α1結(jié)構(gòu)相似，差別僅在于外顯子1的不同。值得注意的是hHIF-3α10，其編碼序列被內(nèi)含子1所阻斷，因此僅編碼7個氨基酸［6－7］。

Fig 2 Multiple spliced variants of the human HIF-3α，Asterisk represents the conserved LXXLL motif

3 HIF-3α的基因表達(dá)

急性缺氧（12%O2，2 h）對 HIF-1α、HIF-2α和 HIF-1β的mRNA水平在心、肺、腎和骨骼肌組織中的表達(dá)沒有明顯的影響，但在上述組織中卻強(qiáng)烈地誘導(dǎo)HIF-3α的mRNA表達(dá)。雖然5個星期的間歇性缺氧訓(xùn)練（intermittent hypoxic training，IHT）可以誘導(dǎo)HIF-3α的mRNA在上述組織的上調(diào)表達(dá)，但是IHT后的急性缺氧除了在骨骼肌組織可以誘導(dǎo)HIF-3α的mRNA表達(dá)上調(diào)外，在其他組織中HIF-3α的mRNA都沒有被誘導(dǎo)。這說明IHT抑制了急性缺氧在心、肺、腎組織中對 HIF-3α的mRNA的誘導(dǎo)作用［12］。hHIF-3α4被認(rèn)為是hHIF調(diào)控系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子。在低氧的刺激下，HIF調(diào)控的基因?qū)患せ顝亩鴳?yīng)對由缺氧造成的細(xì)胞損傷，作為HIF系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子hHIF-3α4將會是被抑制的。在缺氧4 h的條件下，利用實時定量PCR測定HepG2肝癌細(xì)胞和HEK293A人胚腎細(xì)胞中內(nèi)源性的hHIF-3α4的表達(dá)水平，與對照組相比分別降低了75%和50%［13］。這說明hHIF-3α4作為HIF系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子，在低氧狀態(tài)下是被抑制的，從而使細(xì)胞能夠表達(dá)氧應(yīng)激相關(guān)基因來應(yīng)對低氧應(yīng)激。大鼠mHIF-3α（mHIF-3α）的mRNA水平可在急性缺氧的情況被誘導(dǎo)表達(dá)。

令人感到興奮的是，mHIF-3α除了被低氧誘導(dǎo)外，還可以被其他因素誘導(dǎo)。文獻(xiàn)報道［14］，mHIF-3α可以由胰島素和2-脫氧-D-葡萄糖誘導(dǎo)表達(dá)。這提示，mHIF-3α除具有參與低氧應(yīng)激的功能外，還可能具有其他方面的功能，例如可能在糖代謝的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要的作用。

4 HIF3α4的負(fù)調(diào)控作用

HIF-3α4缺少N-TAD、C-TAD和 ODDD結(jié)構(gòu)域，因此被認(rèn)為是HIF系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子。文獻(xiàn)報道，HIF-3α4可以與HIF-1α結(jié)合，從而降低了 HIF1復(fù)合物的水平，對hHIF-1α起負(fù)調(diào)控的作用。HIF-3α4可以抑制HIF-1α／HIF-β復(fù)合物與靶基因HREs序列區(qū)的結(jié)合，從而抑制了HIF-1α調(diào)控的相關(guān)基因的表達(dá)，起到負(fù)調(diào)控的作用［13］。利用HEK293A研究發(fā)現(xiàn)，HIF-3α4可以與HIF-2α相結(jié)合，從而降低HIF2復(fù)合物的量，降低HIF-2α的調(diào)節(jié)作用。研究表明，HIF-3α4與HIF-2α相結(jié)合后將明顯降低HIF-2α與靶基因HREs序列區(qū)的結(jié)合，從而抑制了相關(guān)基因的表達(dá)，起到負(fù)調(diào)控的作用［15］。HIF-3α4也可以與 HIF-β相結(jié)合，可以同時減少體內(nèi)HIF1和HIF2復(fù)合物的量，對HIF-1α和HIF-2α同時起到負(fù)調(diào)控作用［13，15］。

5 HIF-3α在肺發(fā)育過程中的作用

肺的發(fā)育是在相對缺氧的條件下進(jìn)行的，HIF信號通路在肺的發(fā)育過程中起了重要的作用?；騂IF3α／NEPAS／IPAS的缺失會導(dǎo)致剛出生小鼠肺重塑功能的缺損［16］。在小鼠肺上皮細(xì)胞中表達(dá)HIF-3α?xí)?dǎo)致后期支氣管形態(tài)的缺陷、肺泡的數(shù)量降低和改變上皮細(xì)胞類型的分化。實驗表明，HIF-3α基因的表達(dá)，會使Clara細(xì)胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞的數(shù)量有所減少，也使基底細(xì)胞處在非經(jīng)典的空間位置。HIF-3α在小鼠的肺的發(fā)育過程中發(fā)揮作用，主要的機(jī)制是選擇性地抑制了HIF-2α基因的表達(dá)，并上調(diào)Sox2、Rarβ和Foxp2基因的表達(dá)［17］。Sox2基因可以直接影響基底細(xì)胞的外形［18］，Rarβ基因敲除小鼠表現(xiàn)為肺泡提前分隔，肺泡數(shù)量也是正常小鼠的兩倍。所以，HIF-3α上調(diào)Rarβ基因，從而抑制了小鼠的肺在發(fā)育過程中肺泡數(shù)量的增加。Foxp2基因具有抑制Ccsp和遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞標(biāo)記（Spc，T1α）的表達(dá)作用［19］。這解釋了HIF-3α表達(dá)后，Clara細(xì)胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞數(shù)量減少的原因。

6 HIF-3α在脂肪細(xì)胞分化中的作用

HIF-3α除了在肺的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用之外，在其他組織的發(fā)育過程中也具有重要的作用。HIF-3α在3T3-L1細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化過程中被誘導(dǎo)表達(dá)，說明可能是脂肪細(xì)胞分化的促進(jìn)因子，在脂肪細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要的作用?；蛐酒治鰧嶒灡砻鳎?dāng)HIF-3α過量表達(dá)時，兩個已知的脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因，aP2和AMPKγ1表達(dá)是上調(diào)的。脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，可能是由于HIF-3α的LZIP結(jié)構(gòu)域能夠激活脂肪細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)造成的［20］。

7 HIF-3α在增強(qiáng)耐力中的負(fù)調(diào)控作用

抑制HIF-3α的mRNA水平將明顯提高大鼠的身體耐力。除了IHT可以抑制HIF-3α的mRNA水平外，耐力訓(xùn)練（endurance training，ET）也可以抑制 HIF-3α的 mRNA水平。實驗表明大鼠的HIF-3α的mRNA水平在ET聯(lián)合IHT時只有空白對照組的15%，只進(jìn)行ET時為對照組的30%。IHT后的ET訓(xùn)練，大鼠表現(xiàn)出最高的身體耐力水平。利用RNA干擾技術(shù)，在大鼠的比目魚肌和腓腸肌中抑制HIF-3α的表達(dá)，可以明顯的提高大鼠的身體耐力。這說明HIF-3α在大鼠身體耐力增強(qiáng)中具有重要的負(fù)調(diào)控作用［12］。

8 HIF-3α4在腦膜瘤中的作用

腦膜瘤是血管最豐富的腦瘤之一，有效抑制腦膜瘤的血管生成是一種有效的新療法。HIF-1α和HIF-2α在腫瘤的血管生成中具有重要的作用，而HIF-3α4被認(rèn)為是上述兩個α亞基的負(fù)調(diào)控因子。最近的研究表明，在腦膜瘤中HIF-3α4的表達(dá)是受到抑制的，這是由于 HIF-3α4的啟動子區(qū)DNA的甲基化導(dǎo)致的。在富血管腦膜瘤中誘導(dǎo)HIF-3α4高表達(dá)，可以有效地抑制腦膜瘤的血管生成、細(xì)胞分化和物質(zhì)代謝，顯著地阻滯腦膜瘤的生長。因此，HIF-3α4在腦膜瘤中發(fā)揮重要的作用，是潛在的治療腦膜瘤的潛在分子靶點［21］。

9 總結(jié)

HIF是細(xì)胞應(yīng)對氧氣水平降低時的主要調(diào)節(jié)因子，HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α是HIF的3種活性亞基。近年來，對前兩種活性亞基，特別是HIF-1α進(jìn)行了大量的研究工作，對這兩個亞基的基因分布及表達(dá)調(diào)控機(jī)制、激活和降解機(jī)制以及參與生理活動的機(jī)制都有深入的了解，相比前兩個亞基而言，對HIF-3α的研究和認(rèn)識還比較有限。通過最近幾年的研究表明，人體的HIF-3α具有6種剪切變異體，每一種的結(jié)構(gòu)都不一樣，其發(fā)揮的功能也可能不一樣。值得注意的是，hHIF-3α4是負(fù)調(diào)控因子，對HIF信號通路系統(tǒng)起負(fù)調(diào)控作用，使其與其他亞基相比具有獨(dú)特性。研究還提示，HIF-3α呈現(xiàn)出功能的多樣性，除了參與低氧應(yīng)激的反應(yīng)外，還參加了體內(nèi)的其他生理過程，這也是與HIF-1α和HIF-2α不同的。例如HIF-3α參與組織和器官的分化和發(fā)育，以及糖代謝的過程等。由目前的實驗結(jié)果，我們認(rèn)識到HIF-3α的功能是復(fù)雜的，具有獨(dú)特性。因此，深入研究HIF-3α的功能及其作用機(jī)制是及其必要的，將會為腫瘤和高原疾病的治療提供新的思路和策略。

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