阿法替尼和吉非替尼分別聯(lián)合培美曲塞對人肺腺癌細(xì)胞作用的研究

邊 勁，王 琳，尋 琛，黃 偉

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)的臨床應(yīng)用使晚期非小細(xì)胞肺癌的治療獲得了突破性進(jìn)展。吉非替尼、厄羅替尼在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并且取得了很好的療效，但是長期治療幾乎所有患者均會產(chǎn)生耐藥。研究［1－2］顯示二代雙重不可逆性酪氨酸激酶抑制劑阿法替尼(afatinib，BIBW2992)能夠克服肺癌治療中的獲得性耐藥。同時，目前關(guān)于EGFR-TKIs和化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用一直是研究的熱點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)旨在探討B(tài)IBW2992、吉非替尼分別與培美曲塞聯(lián)合對吉非替尼敏感和耐藥型肺腺癌細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，為臨床尋找克服第1代EGFR-TKIs耐藥制定方案提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺腺癌H1975細(xì)胞(EGFR基因外顯子20點(diǎn)突變，耐藥型)、PC-9細(xì)胞(EGFR基因外顯子19缺失，敏感型)由中國人民解放軍第八一醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)科提供;胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Thermo公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Amresco公司;二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;吉非替尼和BIBW2992分別購自英國阿斯利康和德國勃林格殷格翰公司;培美曲塞購自美國禮來公司;內(nèi)參(β-actin)、抗細(xì)胞胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)單克隆抗體一抗購自美國Zymed公司;鼠源二抗購自美國Cell Signaling公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國GE Healthcare公司;BCA試劑盒購自美國Pierce公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC-9、H1975細(xì)胞分別用含10%小牛血清的DMEM、RPMI-1640高糖培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每1～3 d傳代1次。

1.3 MTT法檢測藥物對PC-9、H1975細(xì)胞生長作用影響 取生長良好的PC-9、H1975細(xì)胞制成1×108個/L細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板中，每孔接種100 μl，每組設(shè)置6個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁生長后，再按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入100 μl含有不同濃度 (0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞的培養(yǎng)基作用72 h，每孔加入MTT 20 μl，溫箱內(nèi)孵育4 h棄上清液，加入100 μl鹽酸異丙醇，振蕩儀處理10 min后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm波長下各孔吸光值(A)，計(jì)算出各單藥作用72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)。以BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞分別在2種細(xì)胞中的IC50作為固定濃度單藥及聯(lián)合作用于PC-9、H1975細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組:① PBS對照組(C);② 吉非替尼單獨(dú)作用72 h組(G);③ BIBW2992單獨(dú)作用72 h組(B);④ 培美曲塞單獨(dú)作用72 h組(P);⑤吉非替尼聯(lián)合培美曲塞作用72 h組(G+P);⑥BIBW2992聯(lián)合培美曲塞作用72 h組(B+P)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1－(實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期分布及凋亡

取對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整至1×108個/L，每孔2 ml，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，以BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞分別在2種細(xì)胞中的IC50作為固定濃度單藥及聯(lián)合作用于PC-9、H1975細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞，在－20℃保存過夜。將固定的細(xì)胞離心棄上清液，PBS洗細(xì)胞2次，再次離心棄上清液加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，根據(jù)說明書加入Annexin V-FITC和PI染液，混勻、室溫、避光，反應(yīng)10～15 min，用流式細(xì)胞儀測定PI熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長480 nm，吸收波長630 nm)，檢測細(xì)胞周期分布，并計(jì)算凋亡百分比。

1.5 Western blot法檢測 BIBW2992、吉非替尼對細(xì)胞TS表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整至1×108個/L，每孔2 ml，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組給藥后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下5%牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗(1∶800)搖床孵育過夜，TBST漂洗3次，每次約10 min，二抗(1∶2 000)37℃搖床孵育2 h，TBST漂洗3次，每次約10 min，電化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色，曝光，顯影，凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析，兩組之間互相比較采用配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BIBW2992、吉非替尼單藥及分別與培美曲塞聯(lián)合對細(xì)胞增殖抑制作用 BIBW2992、吉非替尼單藥或分別聯(lián)合培美曲塞均能抑制PC-9、H1975細(xì)胞生長。BIBW2992和吉非替尼單藥作用72 h抑制PC-9細(xì)胞生長的IC50分別為5.81×10－10mol/L和4.54×10－8mol/L，BIBW2992和吉非替尼單藥作用72 h抑制H1975細(xì)胞生長的IC50分別為3.36×10－7mol/L 和1.18 ×10－5mol/L。分別取 BIBW2992、吉非替尼和培美曲塞在2種細(xì)胞中的IC50作為固定濃度研究兩藥聯(lián)合對PC-9和H1975細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果顯示，在PC-9細(xì)胞中(B+P)、(G+P)組較之單藥組生長抑制作用均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在H1975細(xì)胞中僅(B+P)組對細(xì)胞生長抑制有協(xié)同增效作用，較單藥組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 BIBW2992和吉非替尼單藥及分別與培美曲塞聯(lián)合對PC-9、H1975細(xì)胞周期的影響

2.2 BIBW2992吉非替尼單藥及分別與培美曲塞聯(lián)合對細(xì)胞凋亡及周期的影響 培美曲塞單藥作用于2種細(xì)胞時主要將細(xì)胞阻滯在 S期，分別為56.55%、55.98%。BIBW2992、吉非替尼單藥作用于2種細(xì)胞時大部分細(xì)胞主要被阻滯在G0/G1期，在PC-9細(xì)胞中分別為68.33%、64.12%，在 H1975細(xì)胞中分別為60.82%、63.77%。(B+P)、(G+P)組細(xì)胞雜亂的分布于各個周期見圖1。(B+P)、(G+P)組在PC-9細(xì)胞中較之單藥組均明顯提高了凋亡作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而在H1975細(xì)胞中，僅(B+P)組較單藥組誘導(dǎo)凋亡作用明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖2。

2.3 BIBW2992、吉非替尼對 PC-9、H1975 細(xì)胞 TS表達(dá)的影響 在PC-9細(xì)胞中BIBW2992和吉非替尼均可以顯著降低TS，而在H1975細(xì)胞中隨著藥物濃度逐漸增加BIBW2992仍顯著降低TS，而吉非替尼對TS表達(dá)無顯著抑制作用，見圖3。

表1 BIBW2992和吉非替尼分別與培美曲塞聯(lián)合對PC-9、H1975細(xì)胞生長抑制及凋亡作用(%，n=6，±s)

表1 BIBW2992和吉非替尼分別與培美曲塞聯(lián)合對PC-9、H1975細(xì)胞生長抑制及凋亡作用(%，n=6，±s)

與G+P組比較:＊＊P＜0.01;與 B+P組比較:##P ＜0.01

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3 討論

EGFR-TKIs是較早應(yīng)用于臨床抗腫瘤的靶向藥物之一。絕大部分EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者都對可逆性的第1代EGFR-TKIs敏感。但隨著治療時間的延長最終都會產(chǎn)生獲得性耐藥，如EGFR790位點(diǎn)上的蘇氨酸(threonjne)被甲硫氨酸(methlonlne)取代(T790M突變)造成近50%的腫瘤患者產(chǎn)生獲得性耐藥［3］，然而新的不可逆性雙重酪氨酸激酶抑制劑BIBW2992給患者帶來新的希望。BIBW2992不可逆的與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和人表皮受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)酪氨酸激酶結(jié)合抑制其活性，進(jìn)而阻斷EGFR-HER2介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。文獻(xiàn)［1－2］報(bào)道阿法替尼對既往接受過化療及EGFR-TKIs治療失敗的晚期非小細(xì)胞肺癌患者在治療上具有重要意義。文獻(xiàn)［4－5］報(bào)道在EGFR突變患者中一線應(yīng)用BIBW2992與吉非替尼的效果相當(dāng)，并且較之化療明顯延長了患者的無疾病進(jìn)展生存期。

圖2 BIBW2992和吉非替尼分別與培美曲塞聯(lián)合對H1975細(xì)胞凋亡的影響

圖3 BIBW2992、吉非替尼對PC-9、H1975細(xì)胞TS表達(dá)的影響A:PC-9細(xì)胞;B:H1975細(xì)胞

研究［6］顯示BIBW2992雖然可以克服 T790M獲得性耐藥，但是敏感性較之突變敏感型細(xì)胞降低。該實(shí)驗(yàn)中BIBW2992在 H1975細(xì)胞中的 IC50約為PC-9細(xì)胞的600倍，但仍然是臨床治療中可以達(dá)到的血藥濃度［7］，而吉非替尼在耐藥細(xì)胞 H1975中IC50約為PC-9細(xì)胞的300倍，在臨床治療中無法獲得。T790M突變不僅影響B(tài)IBW2992對肺腺癌細(xì)胞的生長抑制作用，同樣降低其他不可逆性EGFRTKIs(如CL-387、785和PF00299804)對肺腺癌細(xì)胞的敏感性［8－9］。因而新型靶向藥物在臨床應(yīng)用對于獲得性耐藥患者盡管有效，但是療效可能會受到一定的限制。目前關(guān)于EGFR-TKIs聯(lián)合化療已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)。研究［10］顯示的一項(xiàng)多中心開放Ⅱ期臨床研究表明培美曲塞同步聯(lián)合厄洛替尼能提高晚期肺癌患者的中位無疾病進(jìn)展時間和中位總生存時間。Yoshimura et al［11］研究中也發(fā)現(xiàn) EGFRTKIs治療耐藥后運(yùn)用培美曲塞序貫聯(lián)合吉非替尼方案患者仍可以明顯獲益。這提示可以將EGFRTKIs與培美曲塞聯(lián)合以期達(dá)到協(xié)同增效作用從而更好的克服EGFR-TKIs耐藥。因而本實(shí)驗(yàn)同時將吉非替尼、BIBW2992分別與培美曲塞聯(lián)合作用于PC-9、H1975細(xì)胞，探討二者是否存在協(xié)同增效作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BIBW2992與培美曲塞聯(lián)合對PC-9、H1975細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡均存在協(xié)同增效作用，而吉非替尼與培美曲塞聯(lián)合僅在PC-9細(xì)胞中起到協(xié)同增效作用，這與Takezawa et al［6］研究結(jié)果基本一致。通過觀察細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培美曲塞主要將細(xì)胞阻滯在S期，而BIBW2992和吉非替尼均將細(xì)胞主要阻滯在G0/G1期，二者聯(lián)合將細(xì)胞雜亂阻滯在各周期，從細(xì)胞周期角度無法解釋兩藥聯(lián)合增效的機(jī)制。

研究［12］顯示吉非替尼和另一種針對TS靶點(diǎn)的藥物S-1聯(lián)合無論在野生型還是突變型細(xì)胞中均可以起到協(xié)同抗腫瘤作用，主要由于吉非替尼降低TS從而增強(qiáng)S-1對肺腺癌細(xì)胞的抑制作用有關(guān)。而在T790M突變的肺腺癌細(xì)胞中，吉非替尼無法顯著降低TS，因而無法起到協(xié)同增效作用［13］。但有研究［6］顯示在吉非替尼耐藥的肺腺癌細(xì)胞系中，BIBW2992仍可以明顯降低EGFR磷酸化以及下調(diào)TS蛋白水平。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的BIBW2992和吉非替尼分別作用于 PC-9、H1975細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，BIBW2992和吉非替尼均可以顯著下調(diào)PC-9細(xì)胞TS，而在H1975細(xì)胞中，BIBW2992仍然可以顯著降低TS，而吉非替尼下調(diào)TS作用不明顯。這可能是BIBW2992與培美曲塞聯(lián)合在吉非替尼耐藥細(xì)胞中仍然可以起到協(xié)同增效作用的主要機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)顯示BIBW2992不僅可以克服吉非替尼耐藥，且與針對TS靶點(diǎn)的藥物培美曲塞聯(lián)用時可以對耐藥細(xì)胞H1975具有協(xié)同增效作用。但是本實(shí)驗(yàn)僅僅選擇了一種T790M突變耐藥細(xì)胞，一種突變敏感型細(xì)胞，因而還有待于在更多不同類型肺腺癌細(xì)胞以及與其他TS靶點(diǎn)藥物(如S-1、5-FU)聯(lián)合加以證實(shí)，同時有待于在體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以期更好的指導(dǎo)臨床方案的選擇。目前，已經(jīng)有研究［14］表明除了T790M突變產(chǎn)生的獲得性耐藥，HER2基因擴(kuò)增在EGFR-TKIs以及西妥昔單抗的獲得性耐藥中同樣存在重要作用，而由于BIBW2992的雙靶點(diǎn)作用，BIBW2992將在未來克服針對EGFR靶向藥物的獲得性耐藥治療中具有更加重大的意義。

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