Eg5基因?qū)Π螂装㏕24細(xì)胞增殖和遷移的影響

陳杰勛，于德新，張志強(qiáng)，王 錚，謝棟棟，王 毅，張 濤，陳 磊，丁德茂，鄒 慈，閔 捷，褚 晗

紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白 Eg5(又稱(chēng) KSP、KIF11、KNSL1)最早是從非洲爪蟾卵中克隆出來(lái)的驅(qū)動(dòng)蛋白超家族，屬于驅(qū)動(dòng)蛋白5家族［1］。Eg5基因位于10q24.1，基因組長(zhǎng)6 216 kbp，含22個(gè)外顯子，編碼分子量為119 ku、1 057個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。Eg5主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，少部分在細(xì)胞核中表達(dá)，通過(guò)磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)紡錘體形成、核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)率等功能，但過(guò)度表達(dá)Eg5會(huì)干擾正常紡錘體的組配和功能獨(dú)特的平衡力，導(dǎo)致紡錘體缺失形成、遺傳不穩(wěn)定和腫瘤發(fā)生［2］。近來(lái)研究［3－5］顯示 Eg5 在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，如前列腺癌、肝癌、肺癌等。Ding et al［6］研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織 Eg5表達(dá)明顯高于正常膀胱組織，且與預(yù)后密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。該研究旨在運(yùn)用小干擾RNA(small interfering，siRNA)沉默 Eg5在膀胱癌 T24細(xì)胞株中表達(dá)，觀察其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖與遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱移行上皮癌T24細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。Eg5鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司);轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamin 2000(美國(guó)Invitrogen公司);RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);噻唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Sigma公司)。3組針對(duì)Eg5基因的siRNA序列參照文獻(xiàn)［7－9］由上海吉瑪制藥有限公司合成:干擾1組正義鏈:5'-CCGAGCUCUCUUAUCAACATT-3'，反義鏈:5'-GAUAAGAGAUCGGTT-3;干擾2組正義鏈:5'-CUCAAGACCUGAAGACAAUTT-3'，反義鏈:5'-AUUGUCUUCAGGUCUUCAGTT-3';干擾3組正義鏈:5'-AGGACAACUGCAGCUACUCTT-3'， 反 義 鏈:5'-GAGUAGCUGCAGUUGUCCUTT-3'。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株在無(wú)菌條件下用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中;次日，當(dāng)T24細(xì)胞豐度為50%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)將T24細(xì)胞分為3組:①干擾組，分別轉(zhuǎn)染3條靶向Eg5-siRNA;②陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA;③空白對(duì)照組，只加入轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染5 h后，更換含血清及抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)T24細(xì)胞 Eg5蛋白的表達(dá) 分別取轉(zhuǎn)染后72 h的各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次后提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法定量蛋白后，分別取各組蛋白30 μg/孔進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA恒流2.5 h后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF，用含5%BSA的TBST室溫封閉1 h;加入相應(yīng)抗體4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育1.5 h，TBST 洗 3 次，每次 10 min，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.3 臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的死亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)整濃度1×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板中，分別在轉(zhuǎn)染 24、48、72 h后收取細(xì)胞，3 200 r/min離心3 min后以適量體積重懸，用0.04%臺(tái)盼藍(lán)溶液與等體積細(xì)胞懸液混勻3 min后計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。細(xì)胞死亡率(%)=死細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制 將各組細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔板，體積200 μl/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h進(jìn)行MTT檢測(cè)，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5 min。經(jīng)酶聯(lián)檢測(cè)儀上于570 nm測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率(IR)。IR(%)=(對(duì)照組A均值－實(shí)驗(yàn)組A均值)/對(duì)照組A均值×100%。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖能力 操作按參考文獻(xiàn)［10］，即細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，再轉(zhuǎn)染1次，48 h后將細(xì)胞以960/孔密度接種于6孔板，與培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d。PBS洗2次，甲醇固定，1%結(jié)晶紫染色，計(jì)算克隆數(shù)，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種到6孔板中，細(xì)胞豐度為95%時(shí)，使用20 μl槍頭在單層細(xì)胞表面劃痕，PBS漂洗2次，更換RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，分別在劃痕后的0、6、12 h拍照觀察細(xì)胞的相對(duì)遷移能力。細(xì)胞遷移距離=(0 h劃痕距離－12 h劃痕距離)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾對(duì)T24細(xì)胞中Eg5表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染72 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，5組細(xì)胞均不同程度表達(dá)Eg5，3組特異性干擾組明顯低于空白對(duì)照組，且干擾3組的Eg5表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度明顯低于干擾1、2兩組，見(jiàn)圖1。選用沉默效率最高的干擾組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)T24細(xì)胞中Eg5蛋白水平的影響

2.2 siRNA干擾對(duì)T24細(xì)胞死亡的影響 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞比較，Eg5基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到T24細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞死亡產(chǎn)生了促進(jìn)作用，表現(xiàn)為在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，干擾組細(xì)胞死亡率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為 －4.48、－22.61、－26.36，P ＜0.05)。而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為－2.01、－2.95、－1.91，P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 siRNA干擾后不同時(shí)間T24細(xì)胞死亡率的變化(%，n=3，±s)

表1 siRNA干擾后不同時(shí)間T24細(xì)胞死亡率的變化(%，n=3，±s)

與空白對(duì)照組比較:#P＜0.05

?

2.3 siRNA干擾后對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T24細(xì)胞行Eg5基因干擾后24～96 h，與空白對(duì)照組細(xì)胞比較吸光度A值降低，陰性對(duì)照組T24細(xì)胞24～96 h增殖抑制率分別為0.72%、0.83%、1.25%、0.78%，干擾組T24細(xì)胞的24～96 h增殖抑制率分別為 5.91%、22.82%、38.50%、41.27%，對(duì)應(yīng)時(shí)程組間增殖抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F 值分別為 113.6、214.7、247.3、517.2，P＜0.05)，見(jiàn)圖2。平板克隆形成抑制的結(jié)果與此一致，干擾組的細(xì)胞克隆形成能力明顯比空白對(duì)照組減弱，干擾組的克隆形成率為(8.2±0.08)%，空白照組、陰性對(duì)照組的克隆形成率分別為(23.61±0.36)%、(22.68±0.26)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.87，P ＜0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4 siRNA干擾后對(duì)T24細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)表明，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、干擾組的遷移距離分別為(593.59±1.73)、(588.97±5.86)、(434.56±8.39)μm，干擾組與空白對(duì)照組、干擾組與陰性對(duì)照組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為32.16、26.13，P ＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖2 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各時(shí)點(diǎn)T24細(xì)胞增殖抑制率

3 討論

膀胱癌亦存在較高的復(fù)發(fā)率，尋找一種新的治療方法已成為一個(gè)重要課題，而近年以siRNA為基礎(chǔ)的基因治療成為膀胱癌新治療手段的研究熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示T24膀胱癌移行細(xì)胞株中存在Eg5陽(yáng)性表達(dá)，且移行細(xì)胞癌是膀胱癌中最常見(jiàn)的腫瘤類(lèi)型，故以T24膀胱癌移行細(xì)胞株為研究對(duì)象具有一定代表性。在采用siRNA沉默Eg5基因后進(jìn)行的Western blot實(shí)驗(yàn)中，T24細(xì)胞中Eg5的蛋白水平明顯下降，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)序列具有特異性。

誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是癌癥治療的一種手段?？刮⒐芤恢笔潜徽J(rèn)為是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的有效方法，但傳統(tǒng)抗微管藥(如紫衫烷類(lèi)及長(zhǎng)春新堿類(lèi))因會(huì)結(jié)合軸突微管引起明顯的周?chē)窠?jīng)病變等毒副作用，因此Eg5作為抗微管的新靶點(diǎn)已成為熱點(diǎn)。有學(xué)者［11］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)多西他賽耐藥的前列腺癌細(xì)胞對(duì)Eg5抑制劑STLC仍然敏感，STLC對(duì)前列腺癌細(xì)胞殺傷作用不受P-糖蛋白水平的影響。本實(shí)驗(yàn)采用臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)Eg5基因能促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞的死亡且存在時(shí)間依賴(lài)性，即隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞死亡率逐漸增加，并且作用在72 h達(dá)最大。

腫瘤形成的特點(diǎn)之一是細(xì)胞增殖不受機(jī)體調(diào)控以及形成大量非整倍體細(xì)胞。Marra et al［12］將特異性Eg5基因用電穿孔方法分別在0、15 d導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞SKOV-3成瘤的裸鼠中，與對(duì)照組比較實(shí)驗(yàn)組中裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)得到明顯抑制，且大部分腫瘤細(xì)胞被抑制在亞G1期。克隆形成能力反映細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要特征，更傾向于反映腫瘤細(xì)胞的“接觸不抑制”特征，是反映腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，RNAi干擾Eg5基因表達(dá)后，膀胱癌細(xì)胞克隆數(shù)目和MTT吸光值明顯下降，這表明沉默Eg5基因在T24細(xì)胞中表達(dá)能抑制T24細(xì)胞的增殖能力，可能與抑制細(xì)胞的過(guò)度有絲分裂、減少其產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞、調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。

圖4 siRNA干擾Eg5基因?qū)24細(xì)胞遷移的影響 ×10A:空白對(duì)照組;B:陰性對(duì)照組;C:干擾組;1:0 h;2:12 h

腫瘤細(xì)胞的發(fā)生是多因素、多步驟、多階段的，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性生物學(xué)行為的主要特征，是引起腫瘤治療失敗和死亡的主要原因。Sun et al［13］研究發(fā)現(xiàn)，dimethylenastron(一種 Eg5 抑制劑)可以明顯抑制高表達(dá)Eg5基因胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA沉默Eg5基因?qū)24細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果表明下調(diào)Eg5蛋白表達(dá)后可顯著抑制T24細(xì)胞的遷移能力。腫瘤的轉(zhuǎn)移能力與其誘導(dǎo)降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜的多種酶相關(guān)［14］，而Eg5有可能上調(diào)此類(lèi)相關(guān)酶類(lèi)物質(zhì)從而促進(jìn)T24細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

［1］Le Guellec R，Paris J，Couturier A，et al.Cloning by differential screening of a Xenopus cDNA that encodes a kinesin-related protein［J］.Mol Cell Bio，1991，11(6):3395 － 8.

［2］Castillo A，Morse H C 3rd，Godfrey V L，et al.Overexpression of Eg5 causes genomic instability and tumor formation in mice［J］.Cancer Res，2007，67(21):10138 －47.

［3］Saijo T，Ishii G，Ochiai A，et al.Eg5 expression is closely correlated with the response of advanced non-small cell lung cancer to antimitotic agents combined with platinum chemotherapy［J］.Lung Cancer，2006，54(2):217 －25.

［4］盧正磊，任維華，莢衛(wèi)東，等.驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(9):1091 －4.

［5］Xing N D，Ding S T，Saito R，et al.A potent chemotherapeutic strategy in prostate cancer:S-(methoxytrityl)-L-cysteine，a novel Eg5 inhibitor［J］.Asian J Androl，2011，13(2):236 － 41.

［6］Ding S，Xing N，Lu J，Zhang H，et al.Overexpression of Eg5 predicts unfavorable prognosis in non-muscle invasive bladder urothelial carcinoma［J］.Int J Urol，2011，18(6):432 －8.

［7］Koller E，Propp S，Zhang H，et al.Use of a chemically modified antisense oligonucleotide library to identify and validate Eg5(kinesin-like 1)as a target for antineoplastic drug development［J］.Cancer Res，2006，66(4):2059 －66.

［8］Rello-Varona S，Vitale I，Kepp O，et al.Preferential killing of tetraploid tumor cells by targeting the mitotic kinesin Eg5［J］.Cell Cycle，2009，8(7):1030 －5.

［9］Matsuda M，Yamamoto T，Matsumura A，et al.Highly efficient eradication of intracranial glioblastoma using Eg5 siRNA combined with HVJ envelope［J］.Gene Ther，2009，6(12):1465 － 76.

［10］Franken N A，Rodermond H M，Stap J，et al.Clonogenic assay of cells in vitro［J］.Nat Protoc，2006，1(5):2315 － 9.

［11］Wiltshire C，Singh B L，Stockley J，et al.Docetaxel-resistant prostate cancer cells remain sensitive to S-trityl-L-cysteine-mediated Eg5 inhibition［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(6):1730 －9.

［12］Marra E，Palombo F，Ciliberto G，et al.Kinesin spindle protein SiRNA slows tumor progression［J］.J Cell Physiol，2013，228(1):58－64.

［13］Sun X D，Shi X J，Sun X O，et al.Dimethylenastron suppresses human pancreatic cancer cell migration and invasion in vitro via allosteric inhibition of mitotic kinesin Eg5［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(12):1543 －8.

［14］張志強(qiáng)，于德新，黃 韻，等.小干擾RNA沉默血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)ACHN腎癌細(xì)胞黏附、侵襲及遷移的影響［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28(11):1947 －9.