應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選轉(zhuǎn)染CDX2基因后胃癌細(xì)胞差異表達(dá)基因

陳曉雙，秦 蓉，儲(chǔ) 婧，陳宗科

胃癌是源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率居我國惡性腫瘤首位。CDX2尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2，位于人類13號(hào)染色體，屬于ParaHox cluster成員。目前國內(nèi)外普遍認(rèn)為CDX2在腸黏膜上皮細(xì)胞的發(fā)育及其形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征的維持過程扮演重要的作用。前期研究［1］顯示CDX2在正常胃黏膜組織、慢性淺表性胃炎中不表達(dá)，在腸化組織中的表達(dá)明顯高于異型增生和胃癌，在胃癌細(xì)胞中CDX2過表達(dá)明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、降低其遷移能力。該文將CDX2基因和空載體分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系BGC-823中，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組BGC-823/CDX2和陰性對(duì)照組BGC-823/EV，利用基因芯片技術(shù)篩選CDX2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞BGC-823后差異表達(dá)基因;應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，Real-time PCR)技術(shù)對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證分析，從而確認(rèn)基因芯片結(jié)果準(zhǔn)確性。通過尋找受CDX2調(diào)控的下游基因，進(jìn)一步探討CDX2基因在胃癌細(xì)胞作用的可能分子機(jī)制，為下一步的功能研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-CDX2、空載體pEGFP-C1和人胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室長期保存。DMEM培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司;胎牛血清購于杭州四季青公司;胰酶購于碧云天生物公司;總RNA提取試劑TRIzol購于美國 Invitrogen公司;基因芯片為Affymetrix Human Genome U133 2.0 Array，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit由加拿大 Fermentas公司提供;Attractene Transfection Reagent、QuantiFast SYBR Green PCR Kit、QuantiFastPrimerAssay(DKK3、FOXP1、TWIST1、GATA6、RUNX3、BMP2 和 β-actin)均由德國QIAGEN公司提供。

1.2 方法

1.2.1 BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 在35 mm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞，取處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化，重懸，以2×105/孔的密度接種于6孔板中，以轉(zhuǎn)染試劑Attractene Transfection Reagent分別介導(dǎo)1.2 μg重組質(zhì)粒pEGFP-C1-CDX2和陰性對(duì)照空載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染9 h后換液，轉(zhuǎn)染24 h后，按照1∶4傳代，接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后用G418進(jìn)行抗性克隆篩選，G418 起初計(jì)量為 400 μg/ml，培養(yǎng) 8 h 后，遞減為200 μg/ml，維持此濃度，直至獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，并分別命名為BGC-823/CDX2和BGC-823/EV。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測 CDX2 基因mRNA表達(dá) 在35 mm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)BGC-823/CDX2、BGC-823/EV和BGC-823 3組細(xì)胞，按照TRIzol說明書提取總 RNA。應(yīng)用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。CDX2和內(nèi)參照GADPH由英駿生物技術(shù)有限公司合成。CDX2上、下游引物分別為5'-ATCATCGAATTCTGCCACCATGTACGTGAGCTACCTCCTGGA CAAG-3'和5'-ATCATCGGATCCTCACTGGGTGACGGTGGGGTTTAGCA-3'，產(chǎn)物大小 961 bp;內(nèi)參照GADPH上、下游引物分別為5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'和 5'-CTGGAAGATGGTGATGGG-3'，產(chǎn)物大小210 bp。取3 μl cDNA按常規(guī)操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 總RNA提取及純化 在35 mm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)BGC-823/CDX2和BGC-823/EV兩組細(xì)胞，48 h后收獲細(xì)胞，按照 TRIzol說明書提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)Nanodrop-1000測定樣本吸光度，經(jīng)RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德國)純化樣本并采用凝膠電泳系統(tǒng)Agilent-2100進(jìn)行檢測。Agilent結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組28S和18S RNA比值符合芯片檢測要求。

1.2.4 制備cDNA和 cRNA 對(duì)兩組樣本總 RNA分別進(jìn)行以下操作:應(yīng)用Affymetrix One-cycle cDNA Synthesis Kit將總RNA依次合成1 st cDNA及2 nd cDNA，合成雙鏈cDNA經(jīng)Affymetrix Genechip Sample Cleanup Module純化。純化后的cDNA經(jīng)Affymetrix GeneChip IVT Labeling Kit轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記cRNA，并應(yīng)用 Genechip Sample Cleanup Module進(jìn)行純化。取15 μg純化后的 cRNA，加8 μl 5×Fragmentation Buffer 和 40 μl RNase-Free Water，混勻，94℃溫浴35 min，反應(yīng)結(jié)束后置于冰上使cRNA片斷化，產(chǎn)生的cRNA片段大小為35～200 bp，可用于芯片雜交。

1.2.5 芯片雜交、洗脫和染色 實(shí)驗(yàn)選用的芯片為Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，該芯片包含人類全基因組47 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，38 500個(gè)明晰的人類基因。取適量片斷化cRNA與芯片進(jìn)行雜交，45 ℃，60 r/min，16 h。雜交完畢后，從芯片中吸出雜交液，應(yīng)用Fluidics Station 450進(jìn)行芯片洗脫和染色。

1.2.6 芯片掃描及數(shù)據(jù)采集 使用Affymetrix GeneChip Scanner 3000對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并采用Affymetrix GeneChip Operating Software(GCOS)Version 1.4軟件對(duì)掃描圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)Ratio值篩選出差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene Ontology富集分析(參考網(wǎng)站http://www.geneontology.org)。

1.2.7 Real-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果 按照TRIzol說明書分別提取BGC-823/CDX2和BGC-823/EV兩組細(xì)胞總RNA。應(yīng)用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將總 RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用QuantiFast SYBR Green PCR Kit進(jìn)行Real-time PCR。DKK3、FOXP1、TWIST1、GATA6、RUNX3、BMP2以及內(nèi)參照β-actin引物均由QIAGEN公司合成。GATA6引物:QT01001133，產(chǎn)物大小 76 bp;RUNX3引物:QT00040306，產(chǎn)物大小69 bp;BMP2引物:QT00012544，產(chǎn)物大小148 bp;DKK3引物:QT00036057，產(chǎn)物大小 173bp;FOXP1引物:QT00064890，產(chǎn)物大小 96bp;TWIST1引物:QT00011956，產(chǎn)物大小127 bp;內(nèi)參照β-actin引物:01680476，產(chǎn)物大小104 bp。Real-time PCR反應(yīng)體系為:95℃，5 min;95℃，10 s;60℃，30 s;重復(fù)40個(gè)循環(huán);溶解曲線溫度范圍:60～95℃。所有樣本做3個(gè)復(fù)孔。獲得樣本Ct值，以β-actin作為內(nèi)參照，根據(jù)相對(duì)定量法2－ΔΔCt計(jì)算差異倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR檢測CDX2基因mRNA表達(dá) RTPCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后顯示，BGC-823/CDX2在961 bp位置可觀測到一條清晰的特異性條帶，而空白對(duì)照組BGC-823和陰性對(duì)照組BGC-823/EV在該位置未出現(xiàn)此條帶，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株BGC-823/CDX2確有CDX2 mRNA的轉(zhuǎn)錄。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測人胃癌BGC-823細(xì)胞CDX2 mRNA表達(dá)M:Marker;1:BGC-823空白對(duì)照組;2:BGC-823/EV陰性對(duì)照組;3:BGC-823/CDX2轉(zhuǎn)染組

2.2 基因芯片 經(jīng)基因芯片篩選CDX2過表達(dá)胃癌細(xì)胞差異表達(dá)基因599個(gè)，其中上調(diào)基因275個(gè)，下調(diào)基因324個(gè)。對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)差異基因涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白酶活性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等方面。部分差異表達(dá)基因見表 1、2。

2.3 Real-time PCR驗(yàn)證分析差異表達(dá)基因 根據(jù)差異表達(dá)基因涉及的不同功能，選擇6個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行Real-time PCR。其結(jié)果顯示，與BGC-823/EV比較，DKK3、FOXP1和 TWIST1在 BGC-823/CDX2中表達(dá)上調(diào)(t=12.100，t=27.845，t=14.072;P ＜0.05)，見圖2;GATA6、RUNX3和 BMP2在BGC-823/CDX2中表達(dá)下調(diào)(t=－5.548，t=－4.643，t= －3.930;P ＜0.05)，見圖 3。Real-time PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說明芯片結(jié)果可靠。

圖2 DKK3、FOXP1和TWIST1在BGC-823/EV和BGC-823/CDX2兩組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平與BGC-823/EV組比較:*P＜0.05

圖3 GATA6、RUNX3和BMP2在BGC-823/EV和BGC-823/CDX2兩組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平與BGC-823/EV組比較:*P＜0.05

表1 部分表達(dá)顯著增強(qiáng)的基因

表2 部分表達(dá)顯著減弱的基因

3 討論

基因芯片技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展與分子生物學(xué)、人類基因組計(jì)劃密不可分，基因芯片擁有高度并行性、高通量、微型化等顯著特點(diǎn)。目前，基因表達(dá)譜芯片可用于檢測腫瘤相關(guān)基因表達(dá)、進(jìn)行腫瘤分類和篩選抗腫瘤藥物等，是消化道腫瘤分子水平研究的重要工具。

CDX2基因在人胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞中低表達(dá)，該研究建立在CDX2過表達(dá)胃癌細(xì)胞系基礎(chǔ)上，利用人類表達(dá)譜芯片對(duì)該細(xì)胞系的表達(dá)譜進(jìn)行初步研究?；蛐酒Y選出表達(dá)差異基因共599個(gè)，其中上調(diào)基因275個(gè)，下調(diào)基因324個(gè)。這些差異表達(dá)基因在細(xì)胞增殖、分化、凋亡，細(xì)胞黏附及細(xì)胞周期等細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，參與腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。

表達(dá)上調(diào)基因中，DDR2、GAS1、FAS、DKK3、TWIST1等與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。DDR2作為受體型酪氨酸激酶通過纖維性膠原被激活，Kawai et al［2］通過建立 ATDC5 細(xì)胞系和miDdr2-transfected ATDC5細(xì)胞系小鼠模型探究DDR2在軟骨細(xì)胞增殖中的作用，推斷DDR2可能負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。GAS1經(jīng)內(nèi)在凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可通過調(diào)節(jié) BCL-2/Bax比值和激活caspase-3誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡［3－4］。死亡受體 FAS是腫瘤壞死因子受體家族重要成員，經(jīng)FAS/FASL通路轉(zhuǎn)導(dǎo)死亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。DKK3是Wnt復(fù)合物受體拮抗劑，在各種類型腫瘤中表達(dá)下調(diào)，經(jīng)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制腫瘤［6］。TWIST1 是堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白家族中的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解［7］，在胃癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要作用［8］。

表 達(dá) 下 調(diào) 基 因 中 PAK1、BDNF、CLDN7、RUNX3、BMP2等參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程。PAK1是典型的進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是小分子 GTPases Rho、Rac1和Cdc42的重要效應(yīng)分子。在胃腫瘤轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)PAK1過表達(dá)時(shí)腫瘤細(xì)胞形成張力纖維和黏著斑復(fù)合物的能力減弱從而影響細(xì)胞骨架重構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞遷移［9］。BDNF與它的主要受體TrkB結(jié)合后，使MMP-1表達(dá)上調(diào)，MMP-1激活肽鏈內(nèi)切酶降解腫瘤微環(huán)境中ECM蛋白從而促進(jìn)人類軟骨肉瘤細(xì)胞遷移，許多腫瘤組織中 BDNF和 TrkB表達(dá)上調(diào)［10］。CLDN7屬于黏附連接蛋白家族成員，主要表達(dá)在彌漫型胃癌，可成為胃腫瘤預(yù)后標(biāo)志物［11］。在正常的胃黏膜上皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子RUNX3經(jīng)TGF-β信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，RUNX3對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞起到保護(hù)性作用［12］。骨形成蛋白BMP2屬于TGF-β超家族，在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中，BMP2信號(hào)通路是通過招募PI3K/AKT和 MAPK通路，從而激活NF-κB 通路，使 MMP-9 激活和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［13］。

與其他研究方法相比，應(yīng)用基因芯片技術(shù)可以快速高效地獲取CDX2過表達(dá)BGC-823細(xì)胞的基因表達(dá)譜，及大量差異表達(dá)基因的信息，從而預(yù)測這些基因的功能和基因間的相互關(guān)系，以及與CDX2基因的調(diào)控關(guān)系。然而芯片結(jié)果主要反應(yīng)基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化，具有一定的局限性。

本研究應(yīng)用人類表達(dá)譜芯片成功篩選出CDX2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞后差異表達(dá)基因，Real-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠。隨后的基因功能分析中獲取了許多CDX2可能作用的候選基因，這些基因都可能是CDX2在胃癌組織發(fā)生作用的靶點(diǎn)，為深入探討CDX2在胃癌中的作用機(jī)制提供了線索。

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