不同牙周治療手段對根面結構及牙周膜細胞生長的影響

王 萌，葉 菁，李 晶，褚云娟，王 欣，陳 芳，劉玲俠，王勤濤

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙周科軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，陜西 西安 710032)

牙周炎是口腔最常見的疾病，菌斑是誘發(fā)牙周炎的主要原因之一，因此菌斑控制是治療及預防牙周炎的重要措施。牙周非手術治療的重點即在于去除菌斑，既有利于牙周組織的愈合，也利于牙周組織正常形態(tài)的恢復［1］。

目前臨床上最經典、常用且療效可靠的基礎治療器械是Gracey手工刮治器，但其對操作者的要求較高，且操作具有一定難度;而不同技術的結合應用則可相互彌補不足，提高療效。如Nd:YAG激光，因其具有一定的滅菌效果［2－3］，且能緩解牙本質敏感等癥狀而被視作牙周治療的補充手段。另外，噴砂技術因能高效去除細小的牙石及色素也被作為補充手段廣泛應用于牙周治療，但由于噴砂砂粒的特性，目前還多應用于齦上潔治中。隨著噴砂技術的發(fā)展以及更光滑細微砂粒的產生，使齦下噴砂成為可能［4］。

本實驗以新鮮拔除的重度牙周炎患牙為對象，分別采用單純Gracey手工刮治、手工刮治結合激光照射、手工刮治結合齦下噴砂對根面進行處理;通過觀察3種方式處理后牙根表面的粗糙程度以及牙周膜細胞在根面粘附、增殖情況的差異，探討不同處理方式對牙根面生物學性能的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素鏈霉素混合液(Hyclone公司，美國);胰蛋白酶(西安科昊生物工程有限公司);Ⅰ型膠原酶(BETTER公司，美國);DMSO(Sigma公司，美國)MTT(Amresco，美國)。TDZ4－WS低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);WS－CJ－2F型超凈工作臺(蘇州泰安空氣技術有限公司);二氧化碳恒溫孵箱(Thermo Scientific，美國);自動酶標檢測儀(Bio－tek，美國);Smart Life口腔激光治療機(DEKA MELA公司，意大利);FT－188齦下潔牙機(EMS公司，瑞士)。

1.2 樣本制備

1.2.1 離體牙選擇

收集因重度牙周炎拔除的磨牙和前磨牙，用生理鹽水沖洗后，從中選取57個(前磨牙20個，磨牙37個)用于實驗。納入標準:①存在齦下牙石;②鄰面牙周袋及附著喪失≥6 mm，X線片示牙槽骨吸收至根尖1/3;③近6個月內未進行過牙周治療、未服用抗生素。排除標準:①患牙根面有齲壞或缺損;②患有全身性疾病。

1.2.2 分組處理和牙根片制備

取上述57個離體牙分別在牙根標記出處理范圍后，用Gracey刮治器以每個根面2 min的標準時間對所有牙齒根面進行刮治處理，要求刮治后的根面無殘留軟組織及牙石附著，根面平整光滑(肉眼觀察)。將處理后的患牙隨機分為A、B、C 3組(每組19個)，其中A組不做特殊處理(單純刮治組)作為對照;B組各牙根面用Nd:YAG激光以20 Hz，100 mJ的能量處理2 min;C組各牙根面以中等能量進行噴砂及水流處理5 s。取上述處理完成后的所有牙齒，分別在水冷卻下從鄰面釉牙骨質界下2 mm處向根方切取5 mm×5 mm×1 mm的根片，每個牙選取1片較平整的根片(共57片，每組19片)浸泡于含有青霉素和鏈霉素的雙抗PBS液中，過夜后干燥、高溫高壓消毒備用。

1.3 各組根片表面形態(tài)學觀察

分別從每組樣本中各隨機抽取2片根片，用20 mL/L戊二醛液4℃下固定24 h后，乙醇梯度脫水、干燥、噴金，掃描電鏡下觀察根片表面形態(tài)并拍照。

1.4 各組根片表面粗糙度檢測

分別從每組樣本中各隨機抽取2個根片，每個根片隨機選擇3個點用原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)進行檢測;并參照 ISO1302－1992的標準，計算各組的輪廓算術平均偏差(Ra)。

1.5 不同根面處理對PDLC粘附、增殖影響的觀察

1.5.1 細胞培養(yǎng)

選取16～25歲健康志愿者(知情同意)因正畸減數(shù)拔除的前磨牙，刮取根中1/3的牙周膜組織用組織塊酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)(用含100 mL/L胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液在37℃、50 mL/L CO2條件下)。每3 d換液，待細胞鋪滿瓶底80%時進行傳代，取生長良好的4代細胞用于以下實驗。

1.5.2 PDLC在各組根片粘附、增殖情況的觀察

將各組所余的15個根片分別置24孔培養(yǎng)板中，每孔3片。然后取第4代PDLC用DMEM制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×10/mL后，取1 mL接種于24孔板各孔中的根片表面，37℃，50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、6、12 h每個時間點每組各取2個根片，PBS漂洗3遍后用20 mmol/L戊二醛液固定(4℃過夜);然后用掃描電鏡觀察細胞在根片上的粘附情況。各組所余9個根片繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)后1、3、5 d每組各取一孔(3個根片)終止培養(yǎng);用PBS漂洗3遍后，避光條件下于每孔中各加入100μL MTT液(5 mg/mL)和100 μL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);4 h后棄原液，避光條件下于每孔中各加入1 mL DMSO，室溫下微量震蕩5 min使甲臜結晶充分溶解，然后從每孔中各吸取200 μL混合液轉多至96孔板(每試樣復5孔)，同時設DMSO為調零孔，用酶標儀分別檢測各孔490 nm波長下的OD值。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，組間均數(shù)比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同處理組的根面形態(tài)比較

掃描電鏡觀察顯示:單純Gracey刮治組的根面有較多玷污層存在，局部可見明顯的劃痕(圖1a);刮治合并激光組的根面玷污層相對較少，且呈熔融狀較為平整(圖1b);刮治合并噴砂組的根面幾乎無玷污層，且表面光滑而平整(圖1c)。

圖1 不同處理組根面掃描電鏡照片(×2 500)

2.2 不同處理組的根面粗糙度比較

本實驗以原子力顯微鏡并等效采用ISO1302－1992的標準對各組根面的粗糙度進行檢測(單位nm)。表面粗糙度是指加工表面具有的微小峰谷不平度，因其兩波峰或兩波谷之間的距離(波距)很小(難以用肉眼加以區(qū)別)，屬于微觀幾何形狀誤差通常以輪廓算術平均偏差Ra評定粗糙度的大小。結果顯示:單純 Gracey刮治組的 Ra=(1.4075±0.3827)×102(圖2a);刮治合并激光組的 Ra=(2.2445±0.3930)×102(圖 2b);刮治合并噴砂組的 Ra=(1.2143±0.3136)×102(圖2c)，各組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

圖2 各組原子力顯微鏡三維重建圖

2.3 不同根面處理對PDLC粘附的影響

牙周膜成纖維細胞接種于不同處理后的根片培養(yǎng)不同時間后，掃描電鏡觀察顯示:1 h時3組細胞均開始附著，但均未伸展而呈圓形皺縮狀(圖3a、d、g)。6 h時，單純刮治組細胞仍未完全伸展而呈皺縮狀(圖3b);而刮治合并激光、噴砂2組細胞則已完全伸展，且可見明顯的細胞質突起(圖3e、h)。12 h時，3組細胞均充分伸展，其中單純刮治組伸展呈梭形，雖可見明顯的細胞突起，但未見明顯融合(圖3c);而刮治合并激光、噴砂2組細胞可見大量的細胞質突起，并融合成片(圖3f、i)。

圖3 各組培養(yǎng)不同時間后掃描電鏡觀察(×500)

2.4 不同根面處理對PDLC增殖的影響

MTT法檢測顯示:牙周膜細胞在3種方法處理的根片上培養(yǎng)1、3、5 d后，各組細胞數(shù)量(OD值)均隨培養(yǎng)時間而逐漸增加，其中刮治合并激光組細胞增殖最明顯，刮治合并噴砂組次之。單純Gracey刮治組最低;各時間點各組間兩兩相比，除1 d時激光組與噴砂組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)外，其他各時間點3組間差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(圖4)。

圖4 各組培養(yǎng)不同時間后細胞增殖情況比較

3 討論

研究表明，牙周炎時處于牙周袋內的患牙根面上附有齦下牙石，且可能會嵌入表層牙骨質;同時，齦下菌斑產生的內毒素也會侵入牙骨質的表層。因此，治療牙周炎的患牙時，除了進行常規(guī)的齦上下潔治外，還要進行齦下刮治和根面平整術(subgingival scaling and root planing，SRP)，以去除嵌入牙骨質的牙石及受內毒素污染的牙骨質;并使根面平整光滑，以利于牙周膜細胞的再附著和牙周組織的愈合。

Gracey刮治器已廣泛用于牙周臨床治療中，并處于不可替代的地位。但Gracey手工刮治對操作者要求較高，且費時費力，長時間操作可能引起醫(yī)生的疲憊，并使之易患腕管綜合征;同時在操作過程中還可能會造成患者感覺不適，術后根面敏感等情況［5］。另外，使用Gracey刮治器進行手工刮治時不僅會造成牙體硬組織表面的劃痕，這種劃痕很可能成為細菌再附著的巢地［6］;而且還會在根面形成玷污層［7－8］。本實驗中也發(fā)現(xiàn)，單純 Gracey手工刮治組的根面不僅存在較多的玷污層，并且在牙根表面造成了明顯的劃痕。

Nd:YAG的熱效應可使蛋白凝固、變性、壞死、汽化，而具有滅菌、消毒的作用［2－3］;并且由激光產生的瞬間高溫作用還可使表面牙骨質熔融，使之形成保護層而封閉牙本質小管［9］。雖然Nd:YAG激光照射并不能去除大塊的牙石，因此也無法替代傳統(tǒng)的手工刮治及根面平整;但在手工刮治后使用激光照射，可有效去除牙周袋內殘存的細菌數(shù)量，并可有效去除根面殘留的玷污層。本實驗中掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，手工刮治合并激光照射時，其根面殘留的玷污層明顯少于單純手工刮治組。而原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，刮治合并激光組的表面粗糙程度明顯高于其他兩組，其原因可能是:激光的熱效應可使表面附著的玷污層汽化，從而使器械造成的根面劃痕更明顯地暴露出來;另外，由于激光光纖的尖端細小(光纖直徑0.3 mm)，只有光纖尖端與根面接觸部分才能發(fā)生蒸發(fā)汽化作用，因此激光的光纖需要在根面反復移動，在移動過程中，光纖在根面各個部分的停留時間可能有所差異，從而造成了根面不同位置激光熱效應作用時間不同，最終導致根面粗糙度增大。有研究認為，激光處理后的根面有利于牙周膜細胞的附著［11－12］，在本實驗中也得到了同樣的結果。將牙周膜細胞接種于不同方法處理后的根面進行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，1 h時3組細胞均未伸展，而呈圓形皺縮樣;6 h后，單純 Gracey刮治組細胞仍未伸展，而激光組和噴砂組細胞均已完全伸展，并可見明顯的細胞突觸;12 h后，單純Gracey刮治組細胞伸展成梭形，而激光組和噴砂組細胞充分伸展并連接成片狀結構。MTT法檢測不同處理方式對細胞增殖的影響時發(fā)現(xiàn)，牙周膜細胞在3種方法處理后的根片表面培養(yǎng)1、3、5 d后，各組的細胞數(shù)量均隨培養(yǎng)時間而逐漸增加，其中激光組細胞增殖最明顯，噴砂組次之，Gracey組最低;各時間點各組間兩兩相比，除1 d時激光組與噴砂組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)外，其他各時間點各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。以上結果提示，根片雖經消毒處理后，其表面及牙本質小管內可能還殘留有內毒素，從而影響細胞的增殖。而激光照射能去除根面和牙本質小管內殘留的細菌及其內毒素，因此激光組更有利于牙周膜細胞的增殖。此外，本實驗中齦下噴砂用的是新型噴砂材料，其主要成分甘氨酸(Glycine)具有一定的打磨能力，而不會過多破壞牙骨質表面的正常結構。有研究發(fā)現(xiàn)，齦下噴砂不僅可有效去除刮治后根面殘留的牙石和菌斑，同時還能起到有效的拋光作用，使根面更加光滑以減少菌斑的再附著［10］。由于噴砂顆粒較小，無法去除大塊的牙石，不能單獨作為治療牙周炎的方式，只能作為Gracey手工刮治的補充手段用于根面平整。

本結果顯示，手工刮治結合齦下噴砂可顯著降低根面的粗糙程度，并促進細胞在根面的附著;而手工刮治結合激光照射則能顯著促進牙周膜細胞在牙根表面的附著和增殖。

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