OK 432優(yōu)化的內(nèi)皮細胞疫苗抗小鼠乳腺癌作用研究

徐茂磊，周 玲，楊小平

（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺 264003）

抗血管生成療法因其具有藥物容易到達靶細胞，不易產(chǎn)生耐藥性，抗瘤譜廣泛，毒副作用小，以及與放化療存在聯(lián)合增效等優(yōu)點，已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的研究熱點。然而，傳統(tǒng)的血管生成抑制劑多為蛋白多肽類藥物或單克隆抗體，蛋白多肽類藥物體內(nèi)半衰期較短，需要頻繁給藥以維持藥效，非人緣化的單克隆抗體應(yīng)用時會出現(xiàn)人抗鼠抗體反應(yīng)（human anti-mouse antibody reaction，HAMA reaction），這些缺點都嚴重限制了傳統(tǒng)血管生成抑制劑抗腫瘤效應(yīng)的發(fā)揮［1］。

近年來，隨著免疫治療技術(shù)的不斷發(fā)展，以自體或異體的內(nèi)皮細胞制備疫苗，利用主動免疫的方式誘導(dǎo)機體產(chǎn)生靶向腫瘤血管的免疫反應(yīng)，殺傷腫瘤新生血管，顯示了一定的抗腫瘤效果［2-5］。然而，臨床實驗證實，僅僅以內(nèi)皮細胞作為抗原制備疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答強度有限，提示我們需要尋找合適的佐劑以提高現(xiàn)行內(nèi)皮細胞疫苗的療效［6］。

OK432是鏈球菌株（streptococcus pyogenes）Su株細胞壁成分的凍干制劑，具有免疫活性作用，可以有效激活DC、NK、抗原特異性的CTL和其它效應(yīng)細胞［7］。此外，OK432刺激成熟的 DC可以通過CD40／CD40L相互作用促進Th1類殺傷性細胞因子的分泌，在腫瘤疫苗的制備中顯示了良好的佐劑效應(yīng)［8］。在我們前期研究中，以O(shè)K432為佐劑，人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）為抗原制備得到了佐劑優(yōu)化的HUVECs-OK432疫苗，該疫苗在B16F10黑色素瘤皮下移植瘤模型中顯示了較強的抗腫瘤活性，并可以明顯降低腫瘤血管的微密度［9-10］。在本研究中，我們擬以EAC乳腺癌作為考查模型，進一步考查HUVECs-OK432疫苗的抗腫瘤藥效，并對相關(guān)的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細胞株 ICR小鼠，♀，5～6周齡，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2007-0001；HUVEC購于美國ATCC細胞庫；小鼠EAC乳腺癌細胞株，購自中科院上海細胞所。

1.1.2 試劑 ECM內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基、內(nèi)皮細胞生長因子ECGS，購自美國Sciencell公司；細胞培養(yǎng)用新生牛血清，購自杭州四季青生物工程材料研究所；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍鹽（MTT）、刀豆蛋白（ConA）為 Sigma公司產(chǎn)品；羊抗小鼠IgG，購自武漢博士德生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、臺盼蘭，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；CytoTox96非放射性細胞毒性檢測試劑盒，購自美國Promega公司；OK432，購自廣州百濟抗腫瘤藥房；其他試劑均為市售。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs-OK432疫苗的制備 用ECM內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基，5%CO2，37℃條件下培養(yǎng) HUVEC，待HUVEC長到80%融合度時胰酶消化，收集HUVEC于離心管中，pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用0.9%生理鹽水將細胞懸液稀釋至5×1010·L-1。取1 ml細胞懸液溶解0.5 KE佐劑OK432，充分混合，即成HUVECs-OK432疫苗。另取1 ml HUVEC細胞懸液為HUVECs疫苗，用1 ml 0.9%生理鹽水溶解0.5 KE OK432為OK432佐劑對照組。

1.2.2 抗腫瘤動物實驗 32只4～5周齡的♀ICR小鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境1周后，隨機分為PBS對照組，OK432組，HUVECs組和HUVECs-OK432組，每組8只。免疫程序如下：于d 0、7、14、21于小鼠右肋皮下注射100μl各組疫苗，對照組注射等量的生理鹽水。在第4次免疫后的1周，即d 28，在各組小鼠左肋皮下接種100μl濃度為5×109·L-1乳腺癌細胞懸液，于腫瘤接種后1周每兩天測量1次腫瘤大小，腫瘤體積按照下列公式計算：V＝0.52×長×寬2。腫瘤接種后d 14處死所有小鼠，剝?nèi)∧[瘤拍照并稱重［10］。

1.2.3 體液免疫反應(yīng)檢測-血清中抗體的 ELISA檢測 采用間接ELISA法檢測免疫血清中的特異性HUVEC抗體，用反復(fù)凍融裂解后的HUVEC細胞裂解物包被96孔ELISA板，1∶50倍稀釋免疫血清，以HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體（1∶10 000稀釋）作為二抗，TMB顯色，用酶標儀測量OD450nm吸光值。

1.2.4 細胞免疫反應(yīng)檢測—脾淋巴細胞增殖反應(yīng)采用MTT法檢測脾淋巴細胞增殖。無菌條件下取各組小鼠的脾臟，研磨成單細胞懸液，加紅細胞裂解液裂解，調(diào)整細胞濃度為5×109·L-1，以100μl／孔加入到96孔細胞培養(yǎng)板中。各組的脾淋巴細胞分別加入空白培養(yǎng)基（陰性對照）、100 mg·L-1HUVEC裂解物，5 mg·L-1的 ConA（陽性對照），每個樣品重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后每孔加入20μl噻唑藍（MTT）溶液，培養(yǎng)4 h后吸去上清，每孔加入100μl二甲基亞砜（DMSO），用酶標儀測量OD570nm吸光值。

1.2.5 CTL實驗 細胞毒性CTL測定采用乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）法，選用 CytoTox96 Promega試劑盒檢測，具體操作步驟按說明書進行。脾淋巴細胞制備方法同上，制備的脾淋巴細胞經(jīng)相應(yīng)的疫苗刺激后，作為效應(yīng)細胞。實驗組、靶細胞自發(fā)釋放組、效應(yīng)細胞自發(fā)釋放組的OD值均需減去培養(yǎng)液背景OD值。靶細胞最大釋放孔的OD值需要減去體積校正孔的OD值。殺傷率按下列公式計算：殺傷率／%＝（實驗組OD-效應(yīng)細胞自發(fā)OD-靶細胞自發(fā)OD）／（靶細胞最大OD-靶細胞自發(fā)OD）×100%。

1.2.6 對血管生成作用的研究-皮內(nèi)免疫模型 4-5周齡ICR小鼠12只，隨機分成4組，分別為PBS對照組、OK432組，HUVECs組和 HUVECs-OK432免疫組，每組3只。按照前述預(yù)防性免疫方式進行4次免疫，第4次免疫結(jié)束后1周于小鼠腹部皮內(nèi)接種EAC腫瘤細胞。在腫瘤細胞接種前1 d，將各組免疫后小鼠的腹部的毛用手術(shù)刀片刮去。調(diào)整EAC腫瘤細胞濃度到1×109·L-1，在小鼠腹部表皮和真皮之間注射腫瘤細胞懸液，每只小鼠選3個點注射，每個點注射50μl（每個點含5×104腫瘤細胞）。皮內(nèi)接種腫瘤細胞后，每天觀察腫瘤情況。當(dāng)瘤塊鼓起約5 mm大小時（約7 d左右），處死動物，小心剝離其腹部外層皮膚。在光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀察腫瘤塊附近以及內(nèi)部的血管分布，計數(shù)1 cm2區(qū)域內(nèi)的所有微血管數(shù)，包括主血管和分支血管。

1.2.7 疫苗安全性考察 小鼠按前述預(yù)防性免疫程序免疫4次，第4次免疫1周后處死所有小鼠，無菌取各組小鼠心、肝、脾、肺、腎，10%的福爾馬林液固定，石蠟包埋，4μm組織切片，常規(guī)HE染色，觀察疫苗對臟器是否存在明顯毒副作用（200×）。

2 實驗結(jié)果

2.1 預(yù)防性動物實驗結(jié)果 動物實驗結(jié)果如Fig 1所示：與 PBS對照組相比，HUVECs（P＜0.05）和HUVECs-OK432（P＜0.05）免疫組小鼠的腫瘤生長速度明顯減慢，且HUVECs-OK432組腫瘤的生長速度與HUVECs組相比也明顯減慢（P＜0.05）。接種腫瘤后3周，剖瘤，瘤重的結(jié)果與腫瘤生長情況相一致。HUVECs和 HUVECs-OK432組小鼠平均瘤重明顯低于PBS組（P＜0.05），且HUVECs-OK432組腫瘤的瘤重明顯小于HUVECs組（P＜0.05），PBS、OK432、HUVECs和HUVECs-OK432四組小鼠的瘤重分別為（2.77±0.41）g、（2.60±0.47）g、（1.56±0.31）g、（0.63±0.29）g。

Fig 1 Prophylactic antitumor effect induced by HUVECs-OK 432 in subcutaneous EAC-bearing m iceA：In vivo measurement of tumor growth；B：Solid tumors excised from mice；C：Weight of tumors.*P＜0.05 vs PBS；#P＜0.05 vs HUVECs.

2.2 抗體檢測 如Fig 2所示，HUVECs和HUVECs-OK432組免疫小鼠的血清中IgG抗體的水平隨著免疫次數(shù)的增多逐漸升高，在第5周時接近頂峰，與PBS組相比較差異有顯著性（P＜0.05）。相比較HUVECs組，HUVECs-OK432組抗體水平也有明顯提高（P＜0.05），而單獨的OK432免疫未能誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生可檢測的抗體。上述結(jié)果表明，OK432作為佐劑能有效協(xié)助HUVECs誘發(fā)更強烈的體液免疫應(yīng)答。

2．3 T淋巴細胞增殖反應(yīng) T淋巴細胞增殖實驗結(jié)果表明（Fig 3），相比較PBS對照組，HUVECs和HUVECs-OK432組小鼠脾淋巴細胞能夠?qū)w外HUVECs抗原刺激產(chǎn)生增殖反應(yīng)（P＜0.05），其中，HUVECs-OK432組小鼠脾淋巴細胞對體外HUVECs抗原刺激的增殖活性最強，和HUVECs組相比較差異也有顯著性（P＜0.05），接近于陽性對照ConA對其的刺激作用。

Fig 2 Characterization of anti-HUVEC antibodies*P＜0.05 vs PBS；#P＜0.05 vs HUVECs.

Fig 3 Effect of different vaccination on T lym phocytes proliferation*P＜0.05 vs PBS；#P＜0.05 vs HUVECs.

2．4 CTL實驗 CTL實驗結(jié)果如Fig 4所示，當(dāng)靶細胞為HUVEC細胞時，HUVECs和HUVECs-OK432免疫組均能引起較強的CTL反應(yīng)，并且隨著效靶比的增大，效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷力也增大。相比較HUVECs免疫組，HUVECs-OK432組效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷能力更強（Fig 4A），而進一步的實驗顯示，所有免疫組小鼠的脾細胞均對EAC腫瘤細胞沒有殺傷功能（Fig 4B）。以上的實驗結(jié)果說明，OK432作為有效的佐劑能特異性的增強HUVEC疫苗對HUVEC細胞的殺傷能力。

2.5 抗血管生成實驗-疫苗免疫對皮內(nèi)腫瘤新生血管的抑制作用 如Fig 5所示，HUVECs和HUVECs-OK432疫苗免疫組腫瘤四周血管稀少，瘤內(nèi)沒有觀察到大量的血管出血，而PBS對照組腫瘤有大量血液供應(yīng)，瘤內(nèi)呈血紅色，顯示瘤內(nèi)血供豐富。與HUVECs組比較，HUVECs-OK432疫苗組血管數(shù)目明顯降低（P＜0.05）。各組血管數(shù)目分別為：PBS 87.56±18.97，OK432 80.23±19.12，HUVECs 45.78±9.87，HUVECs-OK432 20.35±6.35。

2.6 安全性檢查 最后，我們對制備的HUVECs-OK432疫苗的安全性進行了考察。取動物的內(nèi)臟器官（心、肝、脾、肺、腎），外觀上各臟器色澤鮮亮，沒有發(fā)現(xiàn)明顯病變，也沒有異常粘連物質(zhì)。經(jīng)10%甲醛溶液固定后，石蠟包埋等常規(guī)方法處理，4μm厚切片，并用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。切片結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)疫苗對動物各器官存在明顯毒性。

3 討論

Fig 5 Effects of HUVECs-OK 432 immune response on tumor-induced angiogenesis*P＜0.05 vs PBS；#P＜0.05 vs HUVECs.

內(nèi)皮細胞疫苗的抗腫瘤作用已經(jīng)在臨床試驗中得到了初步證實，但是仍然不能完全令人滿意。OK432作為一種免疫增強劑，已經(jīng)較多的應(yīng)用于腫瘤免疫治療，并顯示了良好的佐劑增強作用。在本實驗中，我們以HUVECs作為抗原形式，OK432作為佐劑制備HUVECs-OK432疫苗，并考察了疫苗對EAC乳腺癌生長的抑制作用。實驗結(jié)果顯示：相比較單獨的HUVEC免疫，HUVECs-OK432疫苗免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生了更強的靶向腫瘤新生血管的免疫應(yīng)答，從而大大抑制了EAC乳腺癌的生長，這說明添加合適的佐劑提高內(nèi)皮細胞疫苗抗腫瘤療效的策略是有效的，提示我們可以進一步的對免疫佐劑進行優(yōu)化，從而提升HUVEC疫苗的抗腫瘤效率。

Fig 6 A general observation on toxicity A：PBS；B：HUVECs-OK432

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療的一大難題，也是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的重要原因，越來越多的證據(jù)也顯示腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與腫瘤血管新生密切相關(guān)［11-13］，在本實驗中，我們用皮內(nèi)腫瘤血管模型考察了HUVECs-OK432疫苗對腫瘤血管新生的影響。實驗結(jié)果顯示：和PBS陰性對照組相比，HUVECs-OK432免疫組腫瘤血管數(shù)目明顯降低（20.35±6.35 vs87.56±18.97，P＜0.05），這說明 HUVECs-OK432疫苗免疫有效抑制了腫瘤血管的新生。ELISA檢測抗體水平和CTL殺傷實驗的結(jié)果也進一步證實HUVECs-OK432疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶向腫瘤血管的免疫反應(yīng)是其發(fā)揮抗腫瘤藥效的主要原因。采用疫苗主動免疫的方式，體內(nèi)的免疫應(yīng)答一旦被激發(fā)，可以在一段時間內(nèi)維持高水平，從而可以有效克服傳統(tǒng)的血管生成抑制劑過早停藥引起的病情反跳，有望在預(yù)防腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)上發(fā)揮更好的作用。

綜上所述，本實驗制備了一種OK432優(yōu)化的HUVECs-OK432疫苗，該疫苗可以有效抑制鼠源EAC乳腺癌皮下移植瘤的生長，其抗腫瘤作用與高水平特異性的HUVEC抗體以及淋巴細胞的活化有關(guān)，此次研究為腫瘤治療提供了一種有特色的HUVEC疫苗的腫瘤治療方案，希望也能為更多的腫瘤臨床治療方案提供思路和借鑒。

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