LC-MS／MS法測定人血漿中羥基紅花黃色素A的濃度

李長印，儲繼紅，張 軍，臧雨馨，戴國梁，鄒建東，居文政

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210002）

目前已報(bào)道的人血漿中QA含量的測定方法主要有 HPLC法［5-6］和 LC-MS／MS法［7］。HPLC法由于檢測靈敏度較低，無法保證完全檢測到低給藥劑量下各個(gè)時(shí)點(diǎn)的人體QA血藥濃度，從而保障藥代動(dòng)力學(xué)的順利開展；同時(shí)由于檢測波長下雜質(zhì)干擾的影響，實(shí)現(xiàn)化合物的完全分離和準(zhǔn)確定量往往采用梯度洗脫，因此需要更長的分析時(shí)間，不利于藥代動(dòng)力學(xué)研究中樣品的批量分析。而LC-MS／MS法具有更高的檢測靈敏度和更小的雜質(zhì)信號干擾，因此更適用于測定人血漿中QA的濃度。但在已報(bào)道的LC-MS／MS方法中［7］，研究者采用 SPE方法對血漿樣品進(jìn)行前處理，在進(jìn)樣前必須進(jìn)行吹干和復(fù)溶等操作，具有不利于高通量樣品分析的缺點(diǎn)。同時(shí)，上述報(bào)道中LC-MS／MS方法的建立是為了研究單劑量口服QA制劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究，因此線性范圍偏窄，未進(jìn)行稀釋比實(shí)驗(yàn)等方面的考察。而開展系統(tǒng)的QA人體藥動(dòng)學(xué)研究一般涉及高、中、低3個(gè)劑量組的血藥濃度測定，在保證低劑量組血藥濃度檢測靈敏度的前提下，高劑量組的血藥濃度往往會超出定量上限，因此有必要進(jìn)行稀釋比實(shí)驗(yàn)等相關(guān)考察。基于此，本研究擬對已報(bào)道的測定方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，并對方法進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證，以建立一種靈敏、簡便、快速、可靠的QA人體血藥濃度測定方法，用于人體藥代動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑 羥基紅花黃色素A（QA）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111637-201106，含量92.5%，結(jié)構(gòu)如Fig 1A所示）；異鼠李素-3-O-新橙皮苷（SLS）對照品（內(nèi)標(biāo)，中國食品藥品檢定研究院，批號111571-201205，含量93.2%，結(jié)構(gòu)式見Fig 1B）；醋酸銨（Tedia Company Inc.，HPLC級，批號20266-0500）；甲醇（Merck Company，HPLC級）；超純水由Millipore Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)制備；其余試劑為分析純。注射用QA由廣州悅康生物制藥有限公司提供，25 mg／瓶，臨用前用0.9%氯化鈉注射液250 ml稀釋，靜脈滴注，輸液泵流速4 ml／min。人空白血漿源自江蘇省血液中心。

Fig 1 Chem ical structures of QA（A）and internal standard（SLS，B）

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 LC（Agilent）-（AB）API4000 MS／MS液質(zhì)聯(lián)用儀，含Pump Agilent 1260G1312A、Column Oven Agilent1260G1316A、Auto Sampler Agilent 1260G1367E和 Mass spectrometer API4000，LC-MS／MS系統(tǒng)由Analyst1.6 Software控制；CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）；高速低溫離心機(jī)（Thermo Sorvall Legend Micro 17R，PT021）；WH2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；SPE小柱（waters Oasis＠HLB 3cc（60 mg）Extraction Cartridges）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），Agilent ZORAX SB-C8預(yù)柱（2.1×12.5 mm，5μm），流動(dòng)相組成為 0.2 mol·L-1乙酸銨水溶液／甲醇（30／70），流速400μl／min，柱溫35℃，分析 5 min，進(jìn)樣體積5μl。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，負(fù)離子模式檢測，掃描方式為多反應(yīng)檢測（MRM），QA的檢測目標(biāo)離子對為 m／z 611.131／490.900，DP為 -125 V，CE為-34 eV，SLS的檢測目標(biāo)離子對為 m／z 623.032／298.800，DP為-150 V，CE為 -3462ev。其他主要質(zhì)譜參數(shù)如下：Dwell Time 150 ms，ED-10V，CXP-11V，碰撞氣（CAD）10，氣簾氣（CUR）25，輔助氣 1（GS1）50，輔助氣 2（GS2）55，電噴霧電壓（IS）-4500，離子源溫度（TEM）400。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.1 QA對照品儲備溶液的配制 精密稱取QA對照品11.31 mg（相當(dāng)于含QA 10.46 mg）于10 ml容量瓶中，以甲醇溶解、定容，混勻即得濃度為1.046 g·L-1的QA標(biāo)準(zhǔn)曲線儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用前用甲醇將其逐級稀釋得到含QA濃度分別為 0.1714、0.3428、0.857、2.143、5.356、13.39、33.48、83.69 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

精密稱取QA對照品11.55 mg（相當(dāng)于含QA 10.68 mg）于10 ml容量瓶中，以甲醇溶解、定容，混勻即得濃度為1.068 g·L-1的QA儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用前用甲醇將其逐級稀釋得到含 QA濃度分別為0.3297、2.968、71.23 mg·L-1的系列質(zhì)控工作液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)SLS對照品儲備溶液的配制 精確稱取異鼠李素-3-O-新橙皮苷（SLS）對照品10.66 mg（相當(dāng)于含SLS 9.935 mg）于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到濃度為0.9935 g·L-1的內(nèi)標(biāo)儲備液；將此溶液稀釋500倍，即得濃度為1.987 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)工作液。儲備液和工作液均于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理

2.3.1 受試者含藥血漿樣品處理 取血漿400μl于1.5 ml EP管中，依次加入濃度為1.987 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)工作液20μl、0.2 mol·L-1乙酸銨水溶液400μl，渦旋30 s混勻，12 000×g×5 min，4℃離心，吸取上清液750μl上樣已活化的SPE固相小柱，上樣完畢后用2 ml水洗除雜，最后用70%甲醇水1 ml洗脫，洗脫液渦旋混勻后進(jìn)行LC-MS／MS分析?？瞻籽獫{樣品除了未加內(nèi)標(biāo)之外，其余樣品處理方法相同。

2.3.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的配制與處理 取空白血漿400μl于1.5 ml EP管中，分別加入不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，渦旋混勻，即得含QA濃度分別為 8.570、17.14、42.85、107.1、267.8、669.6、1674、4185μg·L-1的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，后續(xù)處理過程同“2.3.1受試者含藥血漿樣品處理”項(xiàng)下要求。

2.3.3 血漿質(zhì)控樣品的配制與處理 取空白血漿400μl于1.5 ml EP管中，分別加入不同濃度的系列質(zhì)控工作液，渦旋混勻，即得含QA濃度分別為16.49、148.4和3561μg·L-1的系列血漿質(zhì)控樣品，后續(xù)處理過程同“2.3.1受試者含藥血漿樣品處理”項(xiàng)下要求。

2.4 分析方法的驗(yàn)證

Fig 2 Typical LC-MS／MS chromatograms of（A）blank human plasma；（B）QA spiked plasma sample（8．57μg·L-1）for LLOQ；（C）methanol solution of standard m ixture for QA（59．36μg·L-1）and IS（99．35μg·L-1）；（D）QA spiked plasma samp le（148．4μg·L-1）for quality control；（E）p lasma sample obtained from a volunteer at 5 h after drip intravenous infusion of QA injection containing 25 mg of QA

2.4.1 方法的特異性 Fig 2為6份不同來源人空白血漿、定量下限（LLOQ）血漿樣品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、質(zhì)控中濃度血漿樣品和受試者靜滴QA后血漿樣品的特征色譜圖。結(jié)果表明，在選定的LC-MS／MS條件下，血漿樣品中QA和內(nèi)標(biāo)SLS的保留時(shí)間分別在2.7 min和3.9 min左右，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物等不影響QA的準(zhǔn)確測定。

2.4.2 介質(zhì)效應(yīng) 按“2.3.1血漿樣品處理”項(xiàng)處理6種不同來源的空白血漿，獲得其相應(yīng)的空白血漿洗脫液。分別精密吸取QA低、中、高質(zhì)控工作液各20μl，向其中分別依次加入內(nèi)標(biāo)工作液20μl、上述空白血漿洗脫液960μl，渦旋混勻，吸取5μl進(jìn)樣分析。每種來源的空白血漿均需配制低、中、高質(zhì)控濃度樣品，每個(gè)濃度平行3個(gè)樣本。記錄色譜圖、QA峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。計(jì)算6種不同來源血漿樣品同一濃度的（n＝3）和所有濃度的

分別精密吸取QA低、中、高質(zhì)控工作液各20 μl，向其中分別依次加入內(nèi)標(biāo)工作液20μl、甲醇960μl，渦旋混勻，吸取5μl進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度平行3個(gè)樣本。記錄色譜圖、QA峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。計(jì)算同一濃度樣品的（n＝3）和所有樣品的

按下列公式計(jì)算介質(zhì)效應(yīng)：QA的介質(zhì)效應(yīng)ME100%，內(nèi)標(biāo)SLS的介質(zhì)效應(yīng)MEi×100%。QA低、中、高3個(gè)濃度血漿質(zhì)控樣本的平均介質(zhì)效應(yīng)分別為116.62%、119.06%和115.72%，RSD分別為3.27%、3.42%和4.93%，內(nèi)標(biāo)平均介質(zhì)為78.97%，RSD分別為1.53%。結(jié)果表明，該方法中QA及內(nèi)標(biāo)的介質(zhì)效應(yīng)精密且可重現(xiàn)。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、稀釋比考察和定量下限 按照“2.3.2血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的配制與處理”項(xiàng)配制處理并測定血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，記錄色譜圖、QA峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。以QA血藥濃度C為X軸，以 As與 Ai的峰面積比值 f（f＝As／Ai）為 Y軸進(jìn)行權(quán)重回歸（權(quán)重系數(shù)為1／C2），得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝（0.0124±0.0017）X+（0.0269±0.0051）（n＝9），相關(guān)系數(shù)r在0.9949～0.9992之間。結(jié)果表明：血漿中QA濃度在8.570～4185μg·L-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積的比值線性關(guān)系良好。同時(shí)，稀釋比試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度超出定量上限6.25倍（即26 150μg·L-1）以下的QA血漿樣品經(jīng)空白血漿稀釋6.25倍后，實(shí)測濃度的準(zhǔn)確度為88.03%～90.97%，RSD為1.73% ～5.09%，即通過稀釋可以實(shí)現(xiàn)高濃度血漿樣品藥物濃度的準(zhǔn)確測定。

按照“2.3.2血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的配制與處理”項(xiàng)平行配制處理5份血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)樣品并進(jìn)行測定。記錄色譜圖、QA峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。計(jì)算 As和 Ai的比值 y（y＝As／Ai），將 f值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測濃度，進(jìn)而計(jì)算其準(zhǔn)確度和RSD（n＝5）。LLOQ典型色譜圖見 Fig 2。結(jié)果表明：本方法中QA的LLOQ為8.570μg·L-1，實(shí)測濃度的準(zhǔn)確度為97.59%，RSD為4.45%。

2.4.4 精密度和準(zhǔn)確度考察 按“2.3.3血漿質(zhì)控樣本的配制和處理”項(xiàng)配制處理并測定QA低、中、高3種濃度的血漿質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度制備5個(gè)樣本，連續(xù)制備并測定3批。記錄色譜圖、QA峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。計(jì)算As和Ai的比值 f（f＝As／Ai），將f值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測濃度及其準(zhǔn)確度。批內(nèi)和批間精密度分別用批內(nèi)（n＝5）和3批間（n＝15）的濃度實(shí)測值的RSD值表示?？疾旖Y(jié)果如Tab 1所示，結(jié)果表明，該方法的批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度良好。

2.4.5 提取回收率考察 按“2.3.3血漿質(zhì)控樣本的配制和處理”項(xiàng)配制處理并測定QA低、中、高3種濃度的血漿質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度平行3個(gè)樣本。記錄色譜圖、QA峰面積（As）B和內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）B。按“2.3.1血漿樣品的處理”項(xiàng)處理獲得空白血漿洗脫液若干，用于配制未經(jīng)提取含藥血漿樣品。分別精密吸取QA低、中、高質(zhì)控工作液各20μl，向其中分別依次加入內(nèi)標(biāo)工作液20μl、空白血漿洗脫液960μl，渦旋混勻，吸取5μl進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度平行3個(gè)樣本。記錄色譜圖、QA峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。計(jì)算同一濃度樣品的和所有樣品的按下列公式計(jì)算提取回收率：QA的提取回收率×100% ×（840／750），內(nèi)標(biāo) SLS的提取回收率 RECi＝（Ai）B／×100% ×（840／750）。QA低、中、高 3個(gè)濃度血漿質(zhì)控樣本的平均提取回收率分別為77.75%、80.90%和80.76%，RSD分別為1.70%、1.78%和4.15%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為104.57%，RSD分別為5.47%。結(jié)果表明，該方法中QA和內(nèi)標(biāo)的提取回收率精密且可重現(xiàn)。

Tab 1 Intra-and inter-batch precision and accuracy for determ ination of QA in human p lasma

Tab 2 Short-term，freeze-thaw，long-term and post-preparative stability of QA in human p lasma（n＝3）

2.4.6 穩(wěn)定性考察 按“2.3.3血漿質(zhì)控樣本的配制和處理”項(xiàng)配制QA低、中、高3種濃度的血漿質(zhì)控樣本，分別考察血漿樣本室溫放置4 h、-70℃冰箱中保存并反復(fù)凍融3次、-70℃冰箱保存1個(gè)月及樣品處理后自動(dòng)進(jìn)樣器（8℃）中放置24 h的穩(wěn)定性?？疾旖Y(jié)果詳見Tab 2，結(jié)果表明，在上述各種條件下樣品的穩(wěn)定性良好。

2.5 應(yīng)用 36名健康男性受試者，經(jīng)體檢合格，簽署知情同意書，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批同意，均分為低、中、高3個(gè)劑量組進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。3組分別單次靜滴劑量為25、50和75 mg的注射用QA后，于靜滴前、靜滴開始后20、40 min和拔針后 0、10、30、45 min、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、23 h由肘靜脈取血3 ml，置肝素化采血管中，混勻，離心（4 000 r·min-1，4℃，5 min），分離上層血漿，按“2.3.1受試者含藥血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析測定各血漿樣品中QA的濃度。測定結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)劑量組的QA血藥濃度范圍分別為（10.71～2368）、（11.59～4086）、（28.6～4489）μg·L-1。上述結(jié)果表明，所建立的QA血藥濃度LC-MS／MS分析測定方法適用于QA人體藥代動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)研究。

3 討論

3．1 分析方法的優(yōu)化 在方法學(xué)建立過程中，我們對色譜柱、流動(dòng)相組成、樣品前處理和內(nèi)標(biāo)選擇進(jìn)行了系統(tǒng)全面的優(yōu)化。結(jié)果表明：①Agilent ZORBAX SB C18色譜柱分離效果和峰形優(yōu)于Thermo syncronis C8柱；② 流動(dòng)相中加入濃度為0.2 mmol·L-1乙酸銨可提高QA的色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度，而在樣品處理過程中，加入0.2 mol·L-1乙酸銨則可以使QA和內(nèi)標(biāo)的柱保留時(shí)間保持穩(wěn)定；③ 采用固相萃?。⊿PE）法處理血漿時(shí)，QA的提取回收率明顯高于液液萃取法和有機(jī)溶劑沉淀法，waters Oasis＠HLB小柱提取效果優(yōu)于Thermo Soly小柱；④QA血漿樣品分析過程中易出現(xiàn)色譜峰前延現(xiàn)象，在流動(dòng)相中和SPE處理上樣前的樣品中同時(shí)加入乙酸銨可改善峰前延問題，但濃度增高會降低QA和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)，故最終優(yōu)化確定其濃度為0.2 mmol·L-1和0.2 mol·L-1；⑤ 作為定量用內(nèi)標(biāo)，SLS和葛根素在本研究的分析條件下色譜峰峰形良好，而蘆丁色譜峰有拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)；多次反復(fù)進(jìn)樣發(fā)現(xiàn)，SLS的響應(yīng)強(qiáng)度穩(wěn)定，而葛根素的響應(yīng)值有增大趨勢，因此最終選擇SLS作為本方法的內(nèi)標(biāo)。

3.2 分析方法的改進(jìn) 與先前報(bào)道的QA血漿濃度測定的 LC-MS／MS方法［7］相比，本方法的改進(jìn)之處在于：① 通過對高濃度QA血樣進(jìn)行稀釋比考察，擴(kuò)大了分析方法可以準(zhǔn)確定量的濃度范圍。本方法的最終可準(zhǔn)確定量范圍為8.570～26 150μg·L-1，遠(yuǎn)高于先前報(bào)道的1 000倍濃度跨度。②得益于方法學(xué)建立過程的系統(tǒng)優(yōu)化，檢測的靈敏度有所提高，從而減少了血漿樣品用量，即從先前報(bào)道的1 ml減少至400μl。③ 簡化了樣品SPE處理過程，洗脫液即可直接進(jìn)樣分析，無需進(jìn)行吹干、復(fù)溶等繁雜操作。上述改進(jìn)使得本方法能夠?qū)Φ汀⒅?、高不同劑量組受試者的QA血藥濃度實(shí)現(xiàn)簡單快速、靈敏準(zhǔn)確的測定，從而保證系統(tǒng)的QA人體藥代動(dòng)力學(xué)研究的順利開展。

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