PPAR-α激動(dòng)劑對(duì)PAN誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

許俊銘，潘方瑜，劉 源，岳曉陽(yáng)，鄒 軍

（1.廈門(mén)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，福建 廈門(mén) 361102；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 404100）

局灶性腎小球硬化（FSGS）是多種腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)局，同時(shí)也是腎單位退行性病變的必經(jīng)之路。足細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，足細(xì)胞分裂增殖能力有限，一旦損傷丟失就很難再生，其病變所致的足細(xì)胞肥大、足突融合、腎小球基膜（GBM）裸露等一系列變化將最終導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生［1］。

PPAR-α是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，高表達(dá)于脂肪酸代謝旺盛的組織中，如脂肪組織、肝臟、心臟以及腎臟皮質(zhì)，PPAR-α在機(jī)體內(nèi)作用廣泛，除調(diào)節(jié)脂代謝外，還具有抗炎、抗纖維化作用。研究表明［1］，PPAR-α在代謝紊亂綜合征的病理過(guò)程及其相關(guān)腎臟并發(fā)癥中具有關(guān)鍵作用。PPAR-α激動(dòng)劑能夠明顯改善2型糖尿病小鼠尿蛋白水平和腎小球纖維化程度［1-3］。另外一些研究表明［1，4］，PPAR-α缺失的小鼠經(jīng)DOX處理后出現(xiàn)更嚴(yán)重的尿蛋白以及腎小球足細(xì)胞缺失。盡管在許多腎臟疾病中，PPAR-α都表現(xiàn)出保護(hù)作用，但是其在氨基核苷嘌呤霉素（PAN）誘導(dǎo)的大鼠腎小球足細(xì)胞損傷中的作用報(bào)道較少。因此，我們擬通過(guò)建立PAN大鼠腎小球足細(xì)胞損傷模型，以尿蛋白水平的上升和足細(xì)胞損傷標(biāo)志物desmin的表達(dá)上調(diào)作為成模型標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)PPAR-α特異性激動(dòng)劑非諾貝特予以治療，探索PPAR-α激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)足細(xì)胞損傷的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♀ SPF級(jí)8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，體質(zhì)量190～210 g（購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑與儀器 PAN（ENZO Life Science corporation，USA）；非諾貝特（Sigma，USA）；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（BIO-RAD，USA）；ECL（Millipore，USA）；TRIzol（Invitrogen corporation，USA）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher，USA）；SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，Japan）；Desmin rabbit antibody（Dako Cytomation，USA）；GAPDH rabbitantibody（Abcam，USA）；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（北京聯(lián)科生物公司，北京）；冷凍離心機(jī)（Eppendorf，USA）；PCR儀（Thermo Fisher，USA）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（ABI，USA）；酶標(biāo)儀（Molecular Device，USA）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組 SD大鼠18只，隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組（CON組）、PAN模型組（PAN組）、非諾貝特治療組（FEN組）。PAN組和FEN組以65 mg·kg-1體重一次尾靜脈注射PAN（溶解于生理鹽水），CON組一次尾靜脈注射等體積生理鹽水。尾靜脈注射PAN制作模型1 d后，F(xiàn)EN組每日每只以40 mg·kg-1體重非諾貝特灌胃，CON組和PAN每日給予等量的飲用水。分別于造模前1 d（d 0），造模后 d 6（d 6），造模后 d 10（d 10），收集 24 h尿樣測(cè)定尿蛋白濃度，計(jì)算24 h尿蛋白量。d 10對(duì)大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，取出腎臟，收集腎皮質(zhì)并剪成小塊，置于60目滅菌篩網(wǎng)上進(jìn)行研磨，同時(shí)以PBS進(jìn)行沖洗，富含腎小球的部分將掉落于下層的100目篩網(wǎng)上，再以PBS進(jìn)行沖洗，置于最底層的160目篩網(wǎng)將收集最終的腎小球樣本。

1.3.2 Western blot 加入適量裂解液（8 mol·L-1urea，1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1Tris-HCL，pH＝8.0）于腎小球樣本內(nèi)，提取總蛋白，利用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%封閉液室溫封閉1 h，一抗孵育4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育40 min，孵育ECL，顯影曝光。

1.3.3 mRNA檢測(cè) 利用TRIzol試劑盒提取腎小球總RNA（按說(shuō)明書(shū)操作）。取RNA 2μg，加primer-oligo（dT）181μl，補(bǔ)加 DEPC處理水至 12μl，65℃預(yù)變性5min。取出后促冷，分別加入5×Reaction buffer 4μl；Ribo lock 1μl；10 mmol·L-1dNTP 2μl；Revert Aid 1μl，按如下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42.0℃ 60 min；70.0℃ 5 min；95.0℃ 5 min；4.0℃保存。

取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行Real Time PCR，反應(yīng)體系：cDNA 1μl；SYBR Taq酶混合物10μl；ROX 0.4μl；Primer F 0.5μl；Primer R 0.5μl，滅菌水補(bǔ)足至20μl。按如下反應(yīng)體系進(jìn)行Real Time PCR，循環(huán)數(shù)為 40，95.0℃ 1 min（預(yù)變性階段）；95.0℃15 s（變性階段）；60.0℃ 31 s（退火階段）。收集結(jié)果，雙ΔCt法分析結(jié)果。相關(guān)引物序列：bax F：5′-AGACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′；bax R：5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′；Caspase-3 F：5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3′； caspase-3 R：5′-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3′；p38F：5′-CCGAG CGATACCAGAAC-3′；p38 R：5′-CACATC CAACAGACCAATC-3′；GAPDH F：5′-ACCACAGTC CATGCCATCAC-3′；GAPDH R：5′-TCCACCACCCT GTTGCTGTA-3′；desmin F：5′-TCTTTATTGTTTCT GTCCAGGG-3′；desmin R：5′-GCTGTAAGAGAGAA CTGGAAGG-3′；Vimentin F：5′-CGTTTCCAAGCCT GACCTCACG-3′；Vimentin F：5′-GCCATCTTTACAT TGAGCAGGT-3′；TGF-βF：5′-CATTGCTGTCCCGT GCAGA-3′；TGF-βR：5′-AGGTAACGCCAGGAATT GTTGCTA-3′；Smad-7 F：5′-TGCTGTGCAAAGTGTT CAGGTG-3′； Smad-7 R：5′-CCATCGGGTATCTGG AGTAAGGA-3′；ZO-1 F：5′-GCACTGCAACGCTGCC TTTA-3′；ZO-1 R；5′-TTCTCGTGTCTCTGGAGCAG GTA-3′；α-actinin F：5′-GCGAGTGCACAAGATCTC CAAC-3′；α-actinin R：5′-CATGCCCAGGGTCATCTT CA-3′；podocin F：5′-AATTCCTTGTGCAAACCACT ATGA-3′；podocin R：5′-CCAAGGCAACCTTTGCA TCT-3′。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用s表示，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，計(jì)量資料之間差距，采用方差分析進(jìn)行比較，計(jì)數(shù)資料間的差距采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2．1 非諾貝特降低PAN誘導(dǎo)的大鼠24 h尿蛋白水平 注射PAN造模后，PAN組24 h尿蛋白水平在d10明顯上升，F(xiàn)EN組給予非諾貝特治療之后24 h尿蛋白水平較PAN組下降了45%（Fig 1，P＜0.01）。

Fig 1 24 h-urine protein levels between PAN model group and fenofibrate treated group**P＜0.01 vs PAN

2.2 非諾貝特降低足細(xì)胞損傷標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平 在PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后，足細(xì)胞損傷標(biāo)志物Desmin較空白對(duì)照組轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平明顯增加；給予非諾貝特治療后，Desmin轉(zhuǎn)錄和表達(dá)蛋白水平均較 PAN組下降（Fig 2，A、B，P＜0.01）。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這一變化（Fig 2，C）。

Fig 2 Effect of fenofibrate on podocyte injury markerA：Effectof fenofibrate on expression of desmin；B：Effectof fenofibrate on transcription activity of desmin；C：Immunofluorescence photomicrographs of desmin.**P＜0.01 vs PAN；##P＜0.01 vs CON

2.3 非諾貝特改善足細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性 足細(xì)胞遭受損傷后往往會(huì)產(chǎn)生一些代償性變化如肥大，以維持正常的功能。我們?yōu)榱颂剿鱌PAR-α的激活對(duì)這一變化的影響，所以檢測(cè)了與細(xì)胞肥大相關(guān)的細(xì)胞骨架基因的轉(zhuǎn)錄水平。Real-Time PCR結(jié)果顯示，足細(xì)胞骨架蛋白vimentin的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性在PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后均明顯增加，其中轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到空白對(duì)照組的兩倍左右，而在非諾貝特處理后，基因轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)明顯下降（Fig 3，A）。此外，足細(xì)胞其他骨架蛋白nestin和 α-actinin的轉(zhuǎn)錄水平和 vimentin相一致（Fig 3，B、C）。足突相互連接形成的裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過(guò)屏障選擇性濾過(guò)的主要決定因素之一［5］，也是腎小球?yàn)V過(guò)機(jī)械屏障的關(guān)鍵。本研究中，我們檢測(cè)足突裂孔隔膜相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)模型組中，podocin、ZO-1的轉(zhuǎn)錄水平增加，其中podocin的轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到空白對(duì)照組的2.5倍。在非諾貝特組，podocin、ZO-1恢復(fù)到空白對(duì)照水平。但裂孔隔膜蛋白nephrin的轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有明顯變化（結(jié)果未顯示）（Fig 3，D、E）。

2.4 非諾貝特抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性 足細(xì)胞凋亡是足細(xì)胞損傷重要的病理特征，因此，我們檢測(cè)了凋亡通路中的關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)錄水平，探索非諾貝特對(duì)于足細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，PAN造模后，凋亡因子caspase-3的蛋白表達(dá)及其活性片段含量明顯增加，給予非諾貝特處理后caspase-3蛋白表達(dá)及其活性片段含量明顯減少，基本恢復(fù)到空白對(duì)照組水平，其基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)趨勢(shì)統(tǒng)一（Fig 4A，P＜0.01）。bax基因轉(zhuǎn)錄活性變化與caspase-3相一致，在非諾貝特處理后明顯下調(diào)（Fig 4B，P＜0.01）。而凋亡保護(hù)性因子bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有明顯變化（結(jié)果未顯示）。另外，有研究顯示，TGF-β／Smad信號(hào)通路激活和 p38通路的激活都會(huì)足細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，因此，在本研究中我們同時(shí)檢測(cè)了TGF-β／Smad-7和p38通路的活性。PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后，TGF-β／Smad-7通路轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到空白對(duì)照組的兩倍以上（Fig 4C、D，P＜0.01）；經(jīng)過(guò)非諾貝特治療后，TGF-β和Smad-7的轉(zhuǎn)錄水平較PAN模型組下降31%和37%。（Fig 4，C、D，P＜0.01）。p38的結(jié)果和 TGF-β／Smad-7基因結(jié)果一致（Fig 4，E）。

Fig 3 Effect of fenofibrate on podocyte cytoskeletal and junction proteinA：Expression and transcription activity of vimentin；B，C：Transcription activity of nestin and ZO-1；D，E：Transcription activity of podocin andαactinin.##P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs PAN

Fig 4 Effect of fenofibrate on podocyte apoptosisA：Expression and transcription activity of caspase-3；B：Transcription activity of Bax；C，D：Transcription activity of TGF-β／Smad-7；E：Transcription activity of p38.##P＜0.01 vs CON；**P＜0.01 vs PAN

3 討論

本研究通過(guò)PAN建立大鼠腎小球足細(xì)胞損傷模型，探索非諾貝特在PAN誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞損傷中的作用。結(jié)果顯示PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后，尿蛋白水平明顯增加，足細(xì)胞損傷標(biāo)志物Desmin表達(dá)和轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)，表明足細(xì)胞損傷模型成功建立，而給予非諾貝特進(jìn)行治療可以明顯減少尿蛋白的排泄，下調(diào)desmin轉(zhuǎn)錄和表達(dá)活性，恢復(fù)足細(xì)胞骨架蛋白和裂隙膜蛋白的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平，明顯抑制細(xì)胞線粒體凋亡通路和TGF-β／Smd-7通路和p38信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄活性，改善足細(xì)胞損傷。因此，我們的研究表明非諾貝特對(duì)PAN引起的大鼠足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，能夠改善蛋白尿水平，其機(jī)制與抑制足細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。

嘌呤霉素常常被用來(lái)構(gòu)建腎病大鼠模型，該模型是研究微小病變型腎（MCNS）和局灶節(jié)段性腎小球硬化的理想動(dòng)物模型，其最主要的臨床特征為大量蛋白尿［6］，足細(xì)胞損傷和凋亡是PAN大鼠模型另一個(gè)重要的病理表現(xiàn)。越來(lái)越多的研究表明PPAR-α具有腎臟保護(hù)作用［7］，在小鼠中PPAR-α的激活可以改善DOX導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。另外，其他研究表明貝特類(lèi)藥物能夠通過(guò)激活PPAR-α，減少順鉑和阿霉素引起的腎小管損傷。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，PPAR-α缺失導(dǎo)致對(duì)腎小球腎炎的敏感性增加［7］。我們的研究顯示，通過(guò)靜脈注射PAN誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞損傷，引起大鼠尿蛋白水平的明顯增加，而在給予非諾貝特進(jìn)行治療后，尿蛋白水平減輕。Desmin蛋白是一種細(xì)胞骨架絲蛋白，其可作為足細(xì)胞損傷的標(biāo)志性蛋白［8］，正常情況下Desmin蛋白在腎小球足細(xì)胞無(wú)明顯表達(dá)，當(dāng)足細(xì)胞因各種原因發(fā)生損傷時(shí)可大量表達(dá)，其可能原因是足細(xì)胞骨架重新排列。我們的研究中，PAN處理后，Desmin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均明顯上升，而在非諾貝特治療后則明顯下降，與尿蛋白的變化趨勢(shì)一致。

此外，我們還檢測(cè)了足細(xì)胞骨架蛋白和裂隙膜蛋白在PAN處理后的變化。結(jié)果顯示，PAN處理后足細(xì)胞骨架蛋白vimentin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平明顯上調(diào)，其他骨架蛋白nestin、α-actinin的變化與其一致，這可能是因?yàn)镻AN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后，一些足細(xì)胞發(fā)生凋亡，剩余的足細(xì)胞為了覆蓋裸露的基底膜（GBM）而產(chǎn)生代償性肥大，以阻止蛋白從裂孔中漏出［9］；非諾貝特治療后，足細(xì)胞的損傷和凋亡程度減輕，足細(xì)胞代償性肥大減少，骨架蛋白的的轉(zhuǎn)錄活性下降。此外，裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過(guò)屏障選擇性濾過(guò)的主要決定因素之一，因此我們探索了非諾貝特治療PAN足細(xì)胞損傷過(guò)程中對(duì)裂隙膜蛋白的影響，Real-time PCR結(jié)果顯示，在PAN處理后podocin、α-actinin的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，在非諾貝特處理后其轉(zhuǎn)錄活性下降，可能的機(jī)制是PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷和凋亡后，裂孔隔膜遭到破壞，導(dǎo)致相關(guān)蛋白代償性轉(zhuǎn)錄增加，非諾貝特治療后損傷減輕，因此裂孔隔膜相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄下降。但是nephrin的轉(zhuǎn)錄活性在PAN處理后未產(chǎn)生明顯變化，推測(cè)裂孔隔膜中nephrin并非PAN的損傷靶點(diǎn)。

在PAN大鼠足細(xì)胞損傷模型中，足細(xì)胞凋亡是其常見(jiàn)的重要病理特征［7］。在體外實(shí)驗(yàn)中，PAN仍可以誘導(dǎo)體外小鼠足細(xì)胞凋亡。因此，本研究中我們檢測(cè)了非諾貝特對(duì)凋亡通路表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果表明，線粒體凋亡通路中caspase-3在PAN處理后表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性明顯增加，非諾貝特處理后的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性受到明顯抑制，而bax的結(jié)果則進(jìn)一步顯示了非諾貝特在線粒體凋亡通路中的作用，因此推測(cè)非諾貝特可能通過(guò)下調(diào)線粒體凋亡通路，減少足細(xì)胞的損傷和凋亡進(jìn)而產(chǎn)生保護(hù)作用。此外，許多研究表明TGF-β在腎小球疾病中具有重要作用，TGF-β對(duì)腎小球細(xì)胞的增生、肥大、凋亡以及局部和全身免疫反應(yīng)具有重要作用，而且TGF-β是腎小球硬化 （FSGS）的重要介質(zhì)［7，10］，TGF-β／Smad信號(hào)通路激活是足細(xì)胞凋亡重要的啟動(dòng)因素［7，11］。本研究的結(jié)果和以前研究一致，PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后，TGF-β和Smad-7的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，達(dá)到空白對(duì)照組的兩倍以上，而非諾貝特的治療則明顯降低了TGF-β和Smad-7的轉(zhuǎn)錄水平，這提示TGF-β／Smad信號(hào)通路可能也是非諾貝特發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用的作用靶點(diǎn)。最后，以前的研究顯示p38的激活可以在體外誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞的凋亡［12］，因此本研究也初步探索了非諾貝特對(duì)于p38的影響，發(fā)現(xiàn)p38轉(zhuǎn)錄活性在PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后明顯上調(diào)，經(jīng)非諾貝特處理后則受到抑制，這表明非諾貝特可能也通過(guò)p38信號(hào)通路產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，PPAR-α激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)足細(xì)胞損傷具有重要的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制凋亡通路的活性而產(chǎn)生。本研究為非諾貝特在臨床的新用途提供了有力的實(shí)驗(yàn)支持。然而，非諾貝特抑制足細(xì)胞損傷引起的腎小球疾病的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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