克諾羅桿菌檢測(cè)用單克隆抗體的制備及功效評(píng)價(jià)

袁辰剛，楊海榮，楊捷琳，*，吳 楊，陳 穎，潘良文，何宇平

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100123；3.上海友科生物科技有限公司，上海201203）

克諾羅桿菌，原名阪崎腸桿菌。2008年，Iversen建議將阪崎腸桿菌重新分類，成為腸桿菌科1個(gè)新屬，即克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.）。包括5個(gè)新種（其中Cronobacter sakazakii稱為新組合）、1個(gè)克羅諾桿菌基因種（genomospecies）和三個(gè)新亞種[1-3]，2011年增加了一個(gè)新種C.condimenti[4]。Mullane等[5]對(duì)克諾羅桿菌O抗原的研究結(jié)果也支持這一新分類方法。

克諾羅桿菌作為近年來日漸受到關(guān)注的食源性致病菌，感染多見于新生兒和出生3d到4歲左右的嬰幼兒，其中尤以免疫力低下兒童為主。目前為止有9例成人感染克諾羅桿菌病例的報(bào)道[6]。該菌能夠引起嬰兒腦膜炎、膿血癥和小腸結(jié)腸炎[7]，在牛奶中易于形成生物膜，也使這一致病菌的防控更加困難[8]。1961年到2003年報(bào)道的76個(gè)病例中19例死亡，綜合統(tǒng)計(jì)死亡率高達(dá)50%以上[9-10]，也使得各方面對(duì)這一污染來源、生態(tài)學(xué)及毒力因子尚不清楚的微生物更加關(guān)注。WHO/FAO會(huì)議將克諾羅桿菌列為“A”類細(xì)菌，即已經(jīng)確證能夠引起人類疾病的高風(fēng)險(xiǎn)性食源性病原菌[11]。Muytjens等發(fā)現(xiàn)，來自35個(gè)國家的141種嬰兒配方奶粉約14%含有克諾羅桿菌，含量從0.36 ～66.0CFU/100g不等[12]。Nazarowec-White和Farber測(cè)試了加拿大5家不同公司的120罐嬰兒配方奶粉，發(fā)現(xiàn)其中6.7%含有克諾羅桿菌，陽性樣品中克諾羅桿菌的量通常是0.36CFU/100g[13]。2004年，我國阜陽劣質(zhì)奶粉樣品中阪崎腸桿菌（克諾羅桿菌）污染率為12.6%[14]。

現(xiàn)行的《GB 4789.40-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》中，利用克諾羅桿菌特有的α-葡萄糖苷酶活性，采用DFI選擇性平板培養(yǎng)進(jìn)行分離檢驗(yàn)。整個(gè)檢測(cè)過程需要4 ～5d才能完成，周期較長。目前建立的克諾羅桿菌快速檢測(cè)方法以分子生物學(xué)檢測(cè)方法為主，存在專業(yè)技能要求高，設(shè)備昂貴，難以區(qū)分死活細(xì)菌的弊端，而免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立以獲得特異性、靈敏度較好的抗體為基礎(chǔ)，一旦建立，具有應(yīng)用簡(jiǎn)便，成本低廉，快速，高通量等多重優(yōu)勢(shì)。

克諾羅桿菌屬這一新屬的建立，說明了克諾羅桿菌分類學(xué)地位上的復(fù)雜性。目前，克諾羅桿菌代表菌株種類已有9株，菌株之間DNA同源性差異較大，因此增加了抗體制備的復(fù)雜性[2-4]。本文以克諾羅桿菌多個(gè)代表菌株為抗原，進(jìn)行了單抗原、多抗原單獨(dú)免疫、組合免疫的多種嘗試，篩選制備克諾羅桿菌的單克隆抗體，為建立克諾羅桿菌免疫學(xué)快速檢測(cè)方法打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克諾羅桿菌（8株標(biāo)準(zhǔn)菌株）購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Tissue Culture Collection，ATCC）及德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）菌種保藏中心；大腸桿菌（ATCC 25922）、沙門氏菌（ATCC 13076）、陰溝腸桿菌（ATCC 13047）、志賀菌（ATCC 25931）、奇異變形桿菌（ATCC 12453）、肺炎克雷伯氏菌（ATCC 27336）均為上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)技術(shù)中心保存；6 ～8周齡雌性BABL/c小鼠 體質(zhì)量20g左右，購自第二醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；福氏佐劑、PEG 4000、HAT、Protein G Sepharose、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG及小鼠Ig亞類檢測(cè)試劑盒 均購自Sigma公司；Protein G Sepharose硝酸纖維膜 購自上海生工生物技術(shù)公司；RPMI1640培養(yǎng)基 Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清 Hyclone公司產(chǎn)品；小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心（IQCC）保存。

二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋；倒置顯微鏡 上海蔡康；超凈工作臺(tái) 上海上凈；恒溫?fù)u床 上海天呈；超聲破碎儀 寧波新芝；酶標(biāo)儀 美國Thermo。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 動(dòng)物免疫 克諾羅桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃250r/min搖培養(yǎng)過夜，0.5%甲醛滅活，10000r/min離心10min棄上清液，菌體用10mL無菌PBS重懸。抗原制備采用兩種方式結(jié)合：a：超聲裂解：菌體懸液超聲裂解，超聲功率300W，超聲12s，停12s，每輪3min，2輪，裂解液離心（10000r/min，10min），棄去沉淀，上清液即為細(xì)菌裂解蛋白溶液；b：凍融裂解：4℃離心細(xì)菌培養(yǎng)物，PBS洗3次，液氮反復(fù)凍融三次，13000r/min冷凍離心后取上清液。四倍體積冷丙酮沉淀蛋白并洗滌沉淀兩次去除色素等雜質(zhì)，冷凍保存?zhèn)溆?。兩種方式制備的細(xì)菌裂解物按1∶1比例混合作為抗原使用。

克諾羅桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株共8株，分別為ATCC 29544、ATCC 51329、NCTC 9529、DSM 18702、DSM 18703、DSM 18705、DSM 18706、DSM 18707，按照克諾羅桿菌新屬的分類學(xué)研究，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株代表一個(gè)種或亞種的克諾羅桿菌，不同的種或亞種之間基因差異較大，因此推測(cè)其免疫原性也存在差別。因此，選擇8株標(biāo)準(zhǔn)菌株中部分進(jìn)行免疫，分別為DSM 18702、DSM 18705、NCTC 9529、ATCC 29544。

細(xì)菌裂解蛋白溶液用BCA法確定蛋白濃度，即為抗原蛋白，抗原用PBS稀釋至1.5mg/mL，分裝凍存于-20℃，第一次免疫取1000μL抗原與1000μL福氏完全佐劑混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；14d后，取1000μL抗原與1000μL福氏不完全佐劑混合，乳化，腹腔注射6只小鼠免疫；第二次免疫14d后進(jìn)行第三次免疫，取1000μL原與1000μL福氏不完全佐劑混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；第36d進(jìn)行第四次免疫。第四次免疫間隔3d后，小鼠眼眶靜脈采血，收集血清，Elisa檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，血清效價(jià)大于104時(shí)，即達(dá)到進(jìn)行融合的最低標(biāo)準(zhǔn)。融合前3d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取50μg抗原直接腹腔注射6只小鼠；選定合格的小鼠，3d后進(jìn)行細(xì)胞融合。

2018年培訓(xùn)內(nèi)容和形式已逐漸趨向成熟。考慮以后將手機(jī)、電腦聯(lián)機(jī)，操作通過掃描大屏二維碼注冊(cè)使用中、外文數(shù)據(jù)庫，演示檢索過程，讓新員工有更直觀的認(rèn)識(shí)和更深入地參與。

1.2.2 細(xì)胞融合 選擇處于對(duì)數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞，用彎頭吸管將細(xì)胞吹下，收集于50mL離心管中，離心棄上清液，用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸調(diào)整細(xì)胞數(shù)，置孵箱中備用。小鼠摘眼球取血收集血清作為陽性對(duì)照，取脾臟經(jīng)篩網(wǎng)研磨后收集脾細(xì)胞進(jìn)行融合，將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞混勻，1200r/min離心5min，盡量棄去上清液，將細(xì)胞彈松，吸1mL預(yù)熱的融合劑（PEG1450），在1 min內(nèi)逐滴加入，再放置37℃水浴中反應(yīng)1min，然后加入終止液（在5min內(nèi)加入25mL DMEM培養(yǎng)基，并輕輕攪拌細(xì)胞），1200r/min離心5min。棄去上清液，加入100mL預(yù)熱的HAT培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸，輕輕混勻（用吸管從底部吸起細(xì)胞，在液面頂部輕輕盤旋滴入）。用排槍加入預(yù)先接種飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔100μL，鋪10塊板，置孵箱中培養(yǎng)，有限稀釋后接種96孔板，每孔100μL，鋪10塊板，常規(guī)方法進(jìn)行單克隆。

1.2.3 ELISA檢測(cè)抗體效價(jià) 將抗原用CBS稀釋為10μg/mL，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過夜。將包被液棄去，每孔加入200μL封閉液（5%脫脂奶粉），37℃放置1.5h。棄去封閉液，加入樣品，每孔100μL加入酶標(biāo)板，37℃放置1h。酶標(biāo)羊抗鼠用封閉液稀釋至工作濃度，每孔100μL加入酶標(biāo)板，37℃放置30min，用自來水沖洗10次，拍干，加入TMB顯色底物，每孔100μL加入酶標(biāo)板，37℃放置15min，每孔加入2mol/L H2SO450μL終止液，酶標(biāo)儀OD450nm讀數(shù)。

表1 克諾羅桿菌單克隆抗體制備中所用菌株Table 1 Strains used in Cronobacter sakazakii monoclonal antibody screen

1.2.4 抗體腹水制備 預(yù)先腹腔注射石蠟油到小鼠體內(nèi)，將雜交瘤細(xì)胞用彎頭吸管吹打制成懸液，計(jì)數(shù)，用少量DMEM將細(xì)胞重懸，腹腔注射入石蠟鼠體內(nèi)（每只小鼠注射2×106細(xì)胞），處死小鼠吸出腹水，并取少量Elisa檢測(cè)腹水效價(jià)，Protein G柱純化，PBS透析過夜，Elisa檢測(cè)效價(jià)。Protein G純化抗體，紫外吸收測(cè)定濃度，SDS-PAGE進(jìn)行純度分析，-20℃分裝保存。

1.2.5 抗體特異性鑒定 Western blot鑒定：將克諾羅桿菌（ATCC29544）、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、陰溝腸桿菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌各取少量菌液與2×Loading Buffer等體積混合均勻后煮沸10min，每孔12μL上樣（上樣量約為20μg全菌蛋白），SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜（300mA，1h），用5%脫脂奶粉封閉過夜，抗體稀釋至1μg/mL，室溫振蕩孵育1h，洗滌3次，用GE的ECL-PLUS試劑盒曝光，將成像后的膠片掃描保存。

ELISA鑒定：用滅活的菌體作為抗原包被96孔酶標(biāo)板，采用間接ELISA法，設(shè)置空白、陽性、陰性對(duì)照，分別和20種不同菌株進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 單克隆抗體亞類鑒定 按照mAb亞類檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7 親和力的測(cè)定 以80、40、20、10、5、2.5ng/mL濃度的菌體抗原包被96孔板，間接ELISA法檢測(cè)相應(yīng)的OD值，以1000 ～0ng/mL對(duì)倍稀釋的mAb對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制出測(cè)定曲線，以各曲線上部趨于平坦段的OD值為100%，查出其OD值為50%時(shí)的mAb濃度，根據(jù)公式計(jì)算每株mAb的親和力常數(shù)。

1.3 膠體金檢測(cè)試紙條的制備

1.4 靈敏度及特異性測(cè)試

取阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544，37℃過夜培養(yǎng)，10倍梯度稀釋，添加到購買的牛奶中使細(xì)菌終濃度達(dá)到10 ～108CFU/mL，按照GB 4789.40-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)中所述方法，取檢樣加入緩沖蛋白胨水，充分混勻后（36±1）℃培養(yǎng)（18±2）h。將每個(gè)梯度的菌液取1mL進(jìn)行膠體金試紙條檢測(cè)，同時(shí)以緩沖蛋白胨水作為空白對(duì)照。取克諾羅桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株代表株、分離菌株及其他陰性菌株包括沙門氏菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、枸櫞酸桿菌、志賀氏菌、變形桿菌等，接種于5mL肉湯37℃過夜培養(yǎng)，取1mL進(jìn)行膠體金試紙條檢測(cè)，同時(shí)以緩沖蛋白胨水作為空白對(duì)照，確定克諾羅桿菌膠體金試紙條的特異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的篩選和亞克隆

抗原免疫后，雜交瘤細(xì)胞株建立過程中進(jìn)行2次融合，融合率在90%以上。細(xì)胞融合10d后，雜交瘤細(xì)胞克隆生長至肉眼可見時(shí)，采用間接ELISA對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，抗原采用超聲破碎、凍融及全抗原，檢測(cè)結(jié)果表明，超聲破碎的抗原檢測(cè)陽性率最高。篩選出效價(jià)高，特異性好或覆蓋面大的細(xì)胞孔進(jìn)行三次以上的亞克隆。細(xì)胞融合時(shí)，在HAT選擇培養(yǎng)下，一些未融合或自身融合的細(xì)胞死亡，背景雜亂，經(jīng)亞克隆培養(yǎng)后，可見背景相對(duì)干凈的單個(gè)克隆生長。經(jīng)篩選和檢測(cè)獲得6株能穩(wěn)定分泌mAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為：5A8、2H1、1F2、4H11、2H8、5C4。

2.2 單克隆抗體特異性鑒定

選擇克諾羅桿菌陽性菌株共20株，包括8株標(biāo)準(zhǔn)菌株及12株分離株，以及克諾羅桿菌同屬的陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌以及常見的食源性致病菌等9株作為陰性對(duì)照，共29種菌進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（見表2）。從反應(yīng)結(jié)果來看，克諾羅桿菌各標(biāo)準(zhǔn)菌株單獨(dú)或混合作為免疫原，獲得的抗體性質(zhì)差異較大，DSM18702免疫的小鼠選取2只進(jìn)行兩次融合，都沒有篩選到陽性克隆，DSM 18705免疫的小鼠進(jìn)行融合，篩選到陽性克隆，最后建株的單克隆抗體細(xì)胞株均來自菌株DSM 18705免疫所獲得。在所有篩選獲得的細(xì)胞株中，5A8針對(duì)所有的測(cè)試細(xì)菌都有反應(yīng)，雖然該抗體的特異性較差，但由于5A8與實(shí)驗(yàn)中所有的克諾羅桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株都呈陽性反應(yīng)，覆蓋面最大，可以在后續(xù)的膠體金試紙條制備及試劑盒研發(fā)等實(shí)際產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)中作為捕獲抗體，可以提高檢測(cè)的靈敏度，因此在最后的篩選過程中予以保留（見表2）。

圖1 Western Blot檢測(cè)克諾羅桿菌5C4抗體特異性Fig.1 Weatern Blot test of C.sakazakii mAb 5C4 specificity

表2 單克隆抗體特異性測(cè)試Table 2 Specificity test for established C.sakazakii Mabs

采用Western Blot鑒定抗體特異性（圖1），結(jié)果表明，獲得的5C4抗體用于克諾羅桿菌ATCC29544檢測(cè)有陽性條帶出現(xiàn)，但對(duì)于腸炎沙門氏菌、陰溝腸桿菌、福氏志賀氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯氏菌、普通變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等對(duì)照菌株沒有反應(yīng)條帶出現(xiàn)。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水效價(jià)測(cè)定

分別收集陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水，按10倍梯度稀釋，間接ELISA方法檢測(cè)效價(jià)，以P/N值≥2.1時(shí)的最高稀釋倍數(shù)為此單抗的效價(jià)，所制備的單克隆抗體及腹水效價(jià)均能達(dá)到1×107以上。

2.4 單克隆抗體亞類鑒定及親和力的測(cè)定

采用抗體亞類試劑盒測(cè)定，6株單克隆抗體1F2、5C4、2H8、5A8、4H11、2H1的Ig亞類分別為IgG3、IgG2b、IgG3、IgG1、IgG3、IgG1（見表3）。間接ELISA法測(cè)定本研究中的6株mAb的相對(duì)親和常數(shù)均大于1.0×1010L/mol，顯示制備的單抗與克諾羅桿菌的親和力高（見表4）。

表3 單克隆抗體亞類鑒定Fig.3 Subgroup identification of MAb

表4 克諾羅桿菌抗體親和常數(shù)的測(cè)定Fig.4 Measurement of affinity constant bycompetitive

2.5 膠體金試紙條靈敏度及特異性測(cè)試

將克諾羅桿菌培養(yǎng)物梯度稀釋后，用于計(jì)數(shù)和膠體金試紙條檢測(cè)，以確定本方法的靈敏度。結(jié)果顯示，試紙條檢測(cè)靈敏度為105CFU/mL。結(jié)果顯示，試紙條僅對(duì)克諾羅桿菌菌株檢測(cè)為陽性，對(duì)其他細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3 討論

針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)，免疫學(xué)方法一直是必不可少的，具有高通量、快速簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)篩查使用等多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)，ELISA、免疫磁珠、層析試紙條等技術(shù)已經(jīng)成為目前的主流方向。常規(guī)的分離培養(yǎng)和生理生化檢測(cè)，周期長，工作量大，不利于疾病爆發(fā)時(shí)準(zhǔn)確、快速地溯源檢測(cè)，但免疫學(xué)方法建立的基礎(chǔ)是獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)的抗體[15]。

本文采用克諾羅桿菌多株代表菌株DSM 18702、DSM 18705、NCTC 9529、ATCC 29544進(jìn)行免疫，希望能獲得覆蓋面較廣、特異性較好的單克隆抗體。在整個(gè)單克隆抗體制備的過程中，進(jìn)行了多次細(xì)胞融合，多次篩選，工作量極大。實(shí)驗(yàn)獲得了6株克諾羅桿菌的單克隆抗體。一株與多株陰性菌存在交叉反應(yīng)，但同時(shí)也能與所有的克諾羅桿菌陽性菌株反應(yīng)。將該細(xì)胞株建立優(yōu)化后保藏，希望該細(xì)胞株反映的廣泛性能夠在后面的檢測(cè)中獲得運(yùn)用。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)挑選了5株能夠和不同克諾羅桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行反應(yīng)，并且具有良好特異性的單克隆抗體細(xì)胞株建株，這5株細(xì)胞株的結(jié)合能夠完全覆蓋克諾羅桿菌8株代表性標(biāo)準(zhǔn)菌株以及實(shí)驗(yàn)中所用的12株分離株。在Western檢測(cè)抗體特異性的實(shí)驗(yàn)中，選擇了部分克諾羅桿菌和陰性菌株的部分代表菌株，并將這些菌株放在同一張Western檢測(cè)膜上，以減少實(shí)驗(yàn)條件帶來的誤差。本研究的目的是希望將制備獲得的抗體用于最終的實(shí)際檢測(cè)中，由于Western Blot是檢測(cè)在變性狀態(tài)下抗體結(jié)合的特異性，相比較而言，ELISA檢測(cè)更能反映抗體天然狀態(tài)下的特異性，因此本論文中多采用ELISA方法檢測(cè)抗體特異性。

周鶴峰等以一株克諾羅桿菌作為免疫原免疫小鼠后篩選單克隆抗體，獲得的抗體針對(duì)免疫的克諾羅桿菌特異性較好，但由于免疫原和篩選所用抗原的數(shù)量限制，沒有檢測(cè)該抗體對(duì)克諾羅桿菌屬其他細(xì)菌的覆蓋性[16]。在Igor Hoche等制備抗體的過程中，以ATCC 29544標(biāo)準(zhǔn)菌株作為抗原免疫新西蘭白兔，檢測(cè)免疫獲得的多克隆抗體與13株克諾羅桿菌（克諾羅桿菌，其中標(biāo)準(zhǔn)菌株1株，即ATCC29544，其余為分離菌株）的交叉反應(yīng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅對(duì)作為免疫原的ATCC 29544和另一株分離株CNCTC Eb 34/87呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，而對(duì)其他的克諾羅桿菌反應(yīng)均為陰性[17]。

克諾羅桿菌個(gè)別菌株免疫獲得的IgGs具有血清型特異性，與其他的克諾羅桿菌菌株不能反應(yīng)，表明克諾羅桿菌菌株間抗原差異較大，制備的抗血清通用性較差。要解決這個(gè)問題可以采用多種特異性抗體組合應(yīng)用的雞尾酒法，雞尾酒法可以抑制檢測(cè)中的交叉反應(yīng)和非特異性結(jié)合，但這一方式又增加了檢測(cè)優(yōu)化的難度。

另一方面來說，血清型特異性的抗體可以作為克諾羅桿菌血清學(xué)分型的有效工具。血清學(xué)分型是使用較為廣泛的一種分型方式，即制備一系列特異的抗血清，分別將它們與待測(cè)菌株進(jìn)行凝集反應(yīng)，不同菌株帶有的不同表面抗原，會(huì)與不同的血清發(fā)生凝集，根據(jù)凝集結(jié)果進(jìn)行分型。常用到的表面抗原有K抗原（莢膜抗原）、O抗原（菌體抗原）及H抗原（鞭毛抗原）。大多數(shù)腸桿菌科致病菌的抗原都是關(guān)鍵的致病因子，所以血清學(xué)分型在腸桿菌科中應(yīng)用廣泛。

4 結(jié)論

本研究選擇克諾羅桿菌8株標(biāo)準(zhǔn)菌株中的DSM 18702、DSM 18705、NCTC 9529、ATCC 29544菌株分別進(jìn)行免疫，成功制備了針對(duì)克諾羅桿菌的多株單克隆抗體，6株單克隆抗體1F2、5C4、2H8、5A8、4H11、2H1的Ig亞類分別為IgG3、IgG2b、IgG3、IgG1、IgG3、IgG1。多種單抗采用“雞尾酒法”聯(lián)合運(yùn)用能夠完全覆蓋作為陽性對(duì)照的20株克諾羅桿菌。采用抗體亞類試劑盒測(cè)定結(jié)果表明，間接ELISA法測(cè)定本研究中的6株mAb的相對(duì)親和常數(shù)均大于1.0×1010L/mol，顯示制備的單抗與克諾羅桿菌的親和力較高。將克諾羅桿菌抗體應(yīng)用于膠體金試紙條的制備，試紙條檢測(cè)靈敏度為105CFU/mL，且試紙條僅對(duì)克諾羅桿菌菌株檢測(cè)為陽性，對(duì)其他細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性。利用單克隆抗體建立了抗原包被間接ELISA（ACP-ELISA）檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法。為進(jìn)一步研制檢測(cè)阪崎腸桿菌的膠體金免疫試紙條，建立快速的檢測(cè)方法創(chuàng)造條件。

[1]Carol Iversen，Angelika Lehner，Niall Mullane，et al.The taxonomy of Enterobacter sakazakii：proposal of a new genus Cronobacter gen.nov.and descriptions of Cronobacter sakazakii comb.nov.Cronobacter sakazakii sub sp.sakazakii，comb.nov.，Cronobactersakazakiisub sp.malonaticussub sp.nov.，Cronobacter turicensis sp.nov.，Cronobacter muytjensii sp.nov.，Cronobacter dublinensis sp.nov.and Cronobacter genomospecies 1[J].BMC Evolutionary Biology，2007（7）：64-75.

[2]CarolIversen，NiallMullane，Barbara McCardell，etal.Cronobacter gen.nov.，a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii，and proposal of Cronobacter sakazakii gen.nov.，comb.nov.，Cronobacter malonaticus sp.nov.，Cronobacter turicensis sp.nov.，Cronobacter muytjensii sp.nov.，Cronobacter dublinensis sp.nov.，Cronobacter genomospecies 1，and of three subspecies，Cronobacter dublinensis sub sp.dublinensis sub sp.nov.，Cronobacter dublinensis sub sp.lausannensis sub sp.nov.and Cronobacter dublinensis sub sp.lactaridi sub sp.nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2008，58：1442-1447.

[3]Carol Iversen，Angelika Lehner，Niall Mullane，et al.Identification of“Cronobacter”spp.（Enterobacter sakazakii）[J].Journal of Clinical Microbiology，2007，45（11）：3814-3816.

[4]Joseph S，F(xiàn)orsythe S J.Predominance of Cronobacter sakazakii sequence type 4 in neonatal infections[J].Emerg Infect Dis，2011（17）：1713-1715.

[5]Mullane N，O’Gaora P，Nally J E，et al.Molecular analysis of the Enterobacter sakazakii O-antigen gene locus[J].Appl Environ Microbiol，2008，74（12）：3783-3794.

[6]Farmer JJ III，Asbury MA，Hickman FW，et al.Enterobacter sakazakii：a new species of“Enterobacteriaceae”isolated from clinical specimens[J].Int J Syst Bacteriol 30（3）：569-584.

[7]Susan Joseph，Stephen J.Forsythe，Predominance of Cronobacter sakazakii Sequence Type 4 in Neonatal Infections[J].Emerg Infect Dis，2011，17（9）：1713-1715.

[8]G I Dancer，J-H Mah，D-H Kang，Influences of milk components on biofilm formation of Cronobacter spp.（Enterobacter sakazakii）[J].Letters in Applied Microbiology，2009，48：718-725.

[9]Healy B，Cooney S，O’Brien S，et al.Cronobacter（Enterobacter sakazakii）：an opportunistic foodborne pathogen[J].Foodborne Pathog Dis，2010，7（4）：339-350.

[10]Eva Kucerova，Susan Joseph，Stephen Forsythe.The Cronobacter genus：ubiquity and diversity[J].Quality Assurance and Safety of Crops&Foods，2011，3（3）：104-122.

[11]Enterobacter sakazakii（Cronobacter spp.）in powdered follow-up formulae http：//www.who.int/foodsafety/publications/micro/MRA_follow up.pdf.

[12]Muygjens H L，Roelofs W H，Jaspar G H J.Quality of powdered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae[J].Journal of Clinical Microbiology，1988，26：743-746.

[13]Nazarowec-White M，F(xiàn)arber J M.Incidence，survival，and growth of Enterobacter sakazakii ininfant formula[J].Journal of Food Protection，1997，60：226-230.

[14]潘蓓蕾，中國食品工業(yè)與科技藍(lán)皮書[M].北京：中國食品學(xué)報(bào)出版社，2005.

[15]王報(bào)貴，武曉麗，董素琴，等.抗腸炎沙門氏菌單鏈抗體制備及其特異性分析[J].中國生物工程雜志，2013，33（5）：62-67.

[16]周鶴峰，邵敏，于立強(qiáng)，等.阪崎腸桿菌單克隆抗體的制備與特性鑒定[J].中國免疫學(xué)雜志，2012，28（9）：817-820.

[17]Igor Hoche，Jír，Characterisation of antibodies for the immunochemical detection of Enterobacter sakazakii[J].Czech J Food Sci，2009，27（2）：S2-66-S2-74.