RCCS模擬微重力對銅綠假單胞菌莫西沙星敏感度的影響

黃玉玲 易 勇 楊建武 江文俊 賈莉萍 楊鶴鳴 周金蓮 崔 彥 徐冰心

隨著航天事業(yè)的迅猛發(fā)展，太空感染問題亟待深入研究。隨宇航員和太空飛行器進(jìn)入太空的微生物，在失重環(huán)境下其生物學(xué)性狀發(fā)生變化，時刻威脅著宇航員的健康及飛行器的安全[1，2]。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginos)是一種常見的條件性致病菌，阿波羅13號宇宙飛船執(zhí)行任務(wù)過程中，曾有宇航員發(fā)生銅綠假單胞菌引起的泌尿系統(tǒng)感染[3]。Crabbé等[4，5]通過模擬微重力和飛船搭載菌株研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌藻酸鹽、彈性蛋白酶、鼠李糖脂產(chǎn)生增加，其中銅綠假單胞菌POA1菌株有330種基因表達(dá)水平高于對照組1.5倍以上，涉及多種應(yīng)激反應(yīng)蛋白的合成、致病因子的表達(dá)、各種生理代謝的物質(zhì)合成等。目前尚無微重力環(huán)境下銅綠假單胞菌藥物敏感度方面的研究報道。本研究采用三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(rotary cell culture system，RCCS)研究模擬微重力環(huán)境對銅綠假單胞菌莫西沙星敏感度的影響，旨在為航天員的醫(yī)監(jiān)醫(yī)保提供參考依據(jù)。

材料與方法

1.主要試劑和儀器:銅綠假單胞菌ATCC 27853(中國普通微生物菌種保藏管理中心)，LB培養(yǎng)基和MH肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，鹽酸莫西沙星注射液(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，莫西沙星藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司)，SYTO-9(美國Sigma公司)，PI(美國Sigma公司)，全溫震蕩培養(yǎng)箱(太倉市實驗設(shè)備廠)，RCCS(美國Synthecon公司)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)，濁度計(法國生物梅里埃公司)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2.實驗分組和模擬微重力細(xì)菌培養(yǎng):參照文獻(xiàn)[3～5]，將銅綠假單胞菌ATCC 27853劃線接種于血平板上，37℃過夜培養(yǎng);取單一菌落，接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，220r/min過夜培養(yǎng)。取50μl過夜菌懸液接種于5ml新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，新鮮LB培養(yǎng)基調(diào)整菌液終濃度為103。新鮮LB培養(yǎng)基浸洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶10min，棄廢液;菌液加注到50ml培養(yǎng)瓶中，排空氣泡。將培養(yǎng)瓶安置于RCCS上，實驗組(模擬微重力組)培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，對照組(地面重力組)培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直，詳見圖1。于25r/min、37℃下持續(xù)培養(yǎng);每24h更換培養(yǎng)基，過程中注意嚴(yán)格無菌操作，分別于培養(yǎng)第1、7、14天取實驗組和對照組適量菌液，檢測莫西沙星藥物敏感度。

圖1 RCCS模擬微重力環(huán)境及重力環(huán)境的實現(xiàn)

3.肉湯稀釋法檢測最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC):用試管二倍稀釋法測定莫西沙星對實驗組和對照組銅綠假單胞菌ATCC 27853的MIC，操作規(guī)范參照CLSI(M100-S22，2012)標(biāo)準(zhǔn)[6]。

4.K-B紙片法檢測抑菌環(huán)直徑:0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙河脽o菌棉拭均勻涂布于M-H培養(yǎng)基，貼莫西沙星藥敏紙片后置37℃孵箱培養(yǎng)24h，精確量取抑菌環(huán)直徑。

5.流式細(xì)胞儀檢測活菌比例:(1)門設(shè)定:取1ml菌液，M-H肉湯稀釋成濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木?菌液濃度為1.5×108CFU/ml)，再用MH肉湯稀釋20倍，菌液終濃度為7.5×106CFU/ml;取2ml菌液4℃離心4000r/min×2min，加入等體積70%乙醇，重懸菌體;處理10min，4℃離心4000r/min×2min，收集死菌，等體積 PBS重懸;取 2ml菌液，4℃離心4000r/min×2min，收集活菌，等體積PBS重懸;根據(jù)死菌及活菌按1∶0、1∶1、0∶1 比例，混合染色后流式細(xì)胞儀檢測，采集104個菌細(xì)胞，在設(shè)計的測定方案中，以前散射光/側(cè)散射光(FS/SS)直方圖橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)為對數(shù)值，調(diào)節(jié)FS/SS電壓，在此圖中尋找細(xì)菌最集中的區(qū)域，設(shè)門并對門設(shè)置的正確性進(jìn)行驗證，保存數(shù)據(jù)。(2)各藥物濃度下活菌比例檢測:參照文獻(xiàn)[7，8]，取適量菌液，新鮮MH肉湯調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木?菌液濃度為1.5×108CFU/ml);加入莫西沙星注射液，使藥物終濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和0.125μg/ml，菌液終濃度為 7.5 × 106CFU/ml，37℃孵育3h;4℃離心4000r/min×2min，收集菌體，PBS重懸菌體，參照試劑說明書，分別加入SYTO-9和PI染液，使其終濃度為分別為1.67和30μmol/L，標(biāo)記后混勻，4℃共同避光孵育15min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，同時做陽性對照(乙醇?xì)⑺谰鷳乙?、陰性對照(不加藥的菌懸液)，測定各藥物濃度下活菌比例。

6.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多個樣本的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.最低抑菌濃度:各時相點實驗組和對照組莫西沙星對銅綠假單胞菌ATCC 27853的最低抑菌濃度均為 0.25μg/ml。

2.抑菌環(huán)直徑:結(jié)果表明，實驗組莫西沙星對銅綠假單胞菌ATCC 27853的抑菌環(huán)直徑均大于對照組，1、7、14天實驗組與對照組抑菌環(huán)直徑比值分別1.08±0.01、1.12±0.01和1.16±0.01，各時相點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨模擬微重力時相延長，與對照組相比，實驗組抑菌環(huán)直徑逐漸延長(P＜0.05)。

3.門設(shè)定及死活菌檢測結(jié)果:銅綠假單胞菌ATCC 27853 死菌及活菌按 1∶0、1∶1、0∶1 比例，混合染色后流式細(xì)胞儀檢測，門設(shè)定和直方圖結(jié)果見圖2。

4.各藥物濃度下活菌比例:實驗組各藥物濃度下活菌比例均小于對照組，且同一藥物濃度下，實驗組活菌比例與模擬微重力時相呈負(fù)相關(guān)趨勢(P＜0.05，圖 3)。

討 論

圖2 流式細(xì)胞儀藥敏實驗門設(shè)定及死活菌直方圖

近年來，對微重力環(huán)境下致病菌的抗生素敏感度變化日益受到關(guān)注[9]。銅綠假單胞菌是人體常見的條件致病菌之一，是一種致病力較低但抗藥性強(qiáng)的革蘭陰性桿菌。值得重視的是，在“和平號”空間站和國際空間站上均分離到銅綠假單胞菌等多種細(xì)菌[3，10]。

RCCS是研究模擬微重力環(huán)境下微生物性狀變化的一種主要方法。該系統(tǒng)是培養(yǎng)貼壁和懸浮細(xì)胞的裝置，是一種繞水平軸旋轉(zhuǎn)、充滿液體、通過氣液兩相膜進(jìn)行氣體交換的圓柱形旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器，其培養(yǎng)室旋轉(zhuǎn)帶動容器內(nèi)培養(yǎng)液和培養(yǎng)物一起做旋轉(zhuǎn)運動，通過調(diào)整旋轉(zhuǎn)速度可實現(xiàn)培養(yǎng)液和培養(yǎng)物與容器壁同步旋轉(zhuǎn)。培養(yǎng)物在水平軸上建立了近似均質(zhì)液體的懸浮軌道，重力向量持續(xù)隨機(jī)分布，使培養(yǎng)物維持在連續(xù)的自由落體狀態(tài)，作用于細(xì)胞的表觀重力下降，從而在地面上模擬了實驗所需的類似太空的微重力環(huán)境，同時在垂直軸上則可以創(chuàng)造重力環(huán)境[11]。

圖3 各時相點不同濃度莫西沙星作用下活菌比例比值

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，莫西沙星對經(jīng)過RCCS模擬微重力環(huán)境處理過的銅綠假單胞菌的抑菌環(huán)直徑明顯延長，且相同濃度莫西沙星作用下的活菌比例均小于對照組，即14天RCCS模擬微重力能增加銅綠假單胞菌對莫西沙星的敏感度。分析其機(jī)制，可能與RCCS模擬微重力環(huán)境下銅綠假單胞菌桿菌在分子水平及基因水平上應(yīng)激反應(yīng)蛋白變化和致病因子表達(dá)等有關(guān)[2，4，5]。尹煥才等[12]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)回轉(zhuǎn)器處理的大腸桿菌出現(xiàn)抗生素敏感突變株，認(rèn)為G-菌對微重力環(huán)境更加敏感。另有研究表明，模擬微重力條件可促進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞壁增殖，增強(qiáng)其對氯霉素和青霉素以及高滲透壓和乙醇的抵抗能力[13]。模擬微重力條件下鹽古菌對枯草桿菌肽、紅霉素、利福平的抗藥性亦明顯增加，還有研究人員則報道了不同的研究結(jié)果[14]。謝瓊等進(jìn)行的微生物宇宙飛船搭載試驗顯示，微生物經(jīng)搭載后的耐藥性遺傳指標(biāo)基本穩(wěn)定，產(chǎn)超廣譜酶的大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，對頭孢他啶、氧氟沙星、哌拉西林等35種抗生素的耐藥性沒有變化，蠟樣芽胞桿菌對頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢噻肟、哌拉西林的耐藥性有所減弱，但對多數(shù)藥物的耐藥性不變。顯然，不同微生物在微重力環(huán)境下的生物學(xué)特性演變和藥物敏感度變化有可能完全不同，其特點及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，14天 RCCS模擬微重力環(huán)境下莫西沙星對銅綠假單胞菌桿菌的抑菌環(huán)直徑和相同藥物濃度下活菌比例與模擬微重力時相呈負(fù)相關(guān)趨勢，即隨RCCS模擬微重力時相延長，銅綠假單胞菌對莫西沙星的敏感度進(jìn)一步增強(qiáng)。另外發(fā)現(xiàn)，最低抑菌濃度卻沒有明顯變化。尹煥才等[12]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)回轉(zhuǎn)器處理的大腸桿菌抗生素敏感突變株的數(shù)量與處理時間呈正相關(guān)，微重力環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)30天后頭孢他定敏感度增強(qiáng)株的突變率為0.5%，培養(yǎng)60天后突變率增至55%，而120天達(dá)到了65%。Searles等[15]研究低剪切微重力環(huán)境下白色念珠菌的生長變化，發(fā)現(xiàn)隨微重力暴露時間的延長，菌株繁殖增快，結(jié)構(gòu)變異，C白菌毒力增強(qiáng)，對兩性霉素B的耐藥性增大，分析認(rèn)為其歸因于白色念珠菌毒力相關(guān)表型對微重力環(huán)境的迅速適應(yīng)。本研究結(jié)果與前者接近。最低抑菌濃度是傳統(tǒng)的抗生素敏感度試驗檢測項目，通常需要菌液和抗生素共同孵育16～24h，在此過程中，模擬微重力環(huán)境下形成的耐藥性有可能發(fā)生作用，這可能是本實驗研究中未能檢測到最低抑菌濃度變化的主要原因[7]。無論由于微重力環(huán)境下微生物的抗生素敏感突變株形成，還是因為微生物對微重力環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)和耐受，這種截然相反的表現(xiàn)結(jié)果進(jìn)一步說明了微重力環(huán)境下微生物變化/變異以及抗生素敏感度的多樣性和復(fù)雜性。

我國即將開展空間站長期太空飛行，研究太空失重或模擬失重對微生物抗生素敏感度影響及其作用機(jī)制，不僅為闡明微生物與人類之間的相互作用以及航天任務(wù)中航天員感染治療等一系列科學(xué)問題提供理論依據(jù)，而且還對空間微生物安全監(jiān)控等都具有普遍的指導(dǎo)意義。

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