同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6和敵敵畏－甲氧基-D6的合成

楊維成，呂靖，齊慶瑞，盛立彥，李美華，楊超，羅勇

（1.上?；ぱ芯吭?技術(shù)開發(fā)中心 上海200062；2.新疆教育學院 職業(yè)教育分院，烏魯木齊830046）

目前，國內(nèi)針對動物源食品有機磷殘留的檢測方法中，敵百蟲、敵敵畏的檢測方法雖各自不同［4－7］，歸納起來通用的檢測方法主要有：高效液相色譜法 （HPLC）［8－9］、氣 相 色 譜 法 （GC）［15－13］、毛細管電泳法［14］、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（GC／MS）［15－16］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC／MS）等方法［17－21］。其中，LC／MS法是近年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，可在一級質(zhì)譜（MS）條件下，獲得較強的待測物準分子離子峰，并可借助MSn（n＝2～10），對準分子離子峰進行多級裂解，進而獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息［22－23］。此方法可以有效克服敵百蟲（GC／MS檢測時）熱分解造成的實驗誤差，前處理方法也對分析結(jié)果造成較大偏差。

同位素稀釋質(zhì)譜法（isotope dilution mass spectr o metr y，IDMS）是檢測食品、飼料中殘留的有效方法，采用與被測物質(zhì)具有相同分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性同位素（15N，13C，2H等）標記的化合物作為內(nèi)標物質(zhì)，用LC／MS進行檢測，可準確定量。發(fā)達國家對于食品、飼料中的殘留均要求用質(zhì)譜法檢測，并規(guī)定判定標準，如歐盟的2002／657／EC指令。目前，國內(nèi)80%以上的各類農(nóng)殘檢測方法均使用同位素稀釋質(zhì)譜法，通過添加穩(wěn)定同位素內(nèi)標試劑，可有效消除樣品在處理步驟中所引起的回收率差異，從而避免因為樣品處理過程中的損失對檢測結(jié)果造成的偏差，顯著提高目標化合物的回收率和方法穩(wěn)定性。穩(wěn)定同位素內(nèi)標的特性與LC／MS的高靈敏度和處理復雜樣品的能力結(jié)合，使色譜／同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)成為測量微量及痕量有機物的基準方法，應用越來越廣泛。

本研究結(jié)合敵百蟲、敵敵畏工業(yè)合成路線［24－27］，在避免同位素豐度稀釋的前提下，以CD3OD為標記起始原料，經(jīng)與三氯化磷酯化得到亞磷酸二甲酯（I），再進一步與三氯乙醛加成得到敵百蟲－甲氧基-D6（II）。敵百蟲－甲氧基-D6繼續(xù)堿解脫去一分子氯化氫，重排后生成敵敵畏-甲氧基-D6（III），可用于同位素內(nèi)標試劑。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

CD3OD：上?；ぱ芯吭鹤灾疲S度99.5%；敵百蟲（純度97.0%）、敵敵畏（純度95.0%）：Dr.Ehrenstorfer Gmb H 生產(chǎn)，標準品；其余試劑均為市售分析純或化學純，未進一步處理。

高效液相色譜：日本Shi madzu公司；超高液相質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Themo Fisher Scientific公司；紅外吸收光譜儀：美國Nicolet公司；核磁共振儀：瑞士Br uke公司。

1.2 敵敵畏－甲氧基-D6 的合成

1.2.1 亞磷酸二甲酯-D6（D7）的合成

2.樹立現(xiàn)代治理理念?；ヂ?lián)網(wǎng)精神與現(xiàn)代治理理念具有內(nèi)在契合性，地方政府治理要堅定共享共治、開放透明、自由平等、民主法治的理念，超越威權(quán)思維，乘著 “互聯(lián)網(wǎng)+”東風，向建設法治政府、透明政府、有限政府、服務型政府的目標扎實邁進。要以公眾為中心、以治理效能為導向，促進公共產(chǎn)品和公共服務的 “互聯(lián)網(wǎng)+”大發(fā)展。要充分接納各治理主體的自主性并充分發(fā)揮其創(chuàng)造性，處理好政府、企業(yè)、社會之間關(guān)系，廣泛整合治理資源，培育有機的治理生態(tài)。要以規(guī)則為準繩，不斷規(guī)范政府治理行為，樹立良好的政府形象。

將5.40 g（0.15 mol）CD3OD溶于18.5 mL的二氯甲烷中，6.86 g（0.05 mol）PCl3溶于10 mL二氯甲烷，在0～2℃下向CD3OD溶液中滴加PCl3溶液，滴加時間為0.5 h。滴加結(jié)束后，迅速升溫至69℃，在該階段溶液回流并有大量氣泡產(chǎn)生，保溫50 min后，待氣體產(chǎn)生停止后終止反應。旋蒸后減壓蒸餾，收集71～75℃（720 mm Hg）的餾分，稱量后計算收率為84.5%，化學純度在98%以上，氘同位素豐度為98.4%。LC-MS-ESI-：［M＋H］＋＝117、118。

1.2.2 同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6的合成

往圓底燒瓶中加入6.58 g（45 mmol）三氯乙醛，在70℃下滴加5.0 g（43 mmol）同位素標記的亞磷酸二甲酯，30 min后滴加結(jié)束。迅速升溫至80℃并保溫2 h至反應結(jié)束，將產(chǎn)品轉(zhuǎn)移進行結(jié)晶，得到的固體稱重為11.66 g，粗收率大于100%。產(chǎn)品進行5次重結(jié)晶后，總收率（以CD3OD計）為57.7%，化學純度為98.5%，氘同位素豐度為98.4%。

1.2.3 同位素標記敵敵畏－甲氧基-D6的合成

取6.2 g（24 mmol）敵百蟲－甲氧基-D6重結(jié)晶樣品溶于44 g蒸餾水中，再加入20 mL苯，在5℃的水浴下滴加5%Na OH溶液30 mL，5 min之內(nèi)滴加結(jié)束，升溫至40℃，保溫1 h，反應結(jié)束后分液、干燥、旋蒸，得到粗產(chǎn)品4.23 g，最后減壓蒸餾得到產(chǎn)品3.2 g，計算總收率（以CD3OD計）為47.3%，經(jīng)檢測化學純度為98.2%，氘同位素豐度為98.2%。

1.3 純度分析

采用氣相色譜分析亞磷酸二甲酯純度。色譜柱：SPB-5柱；載氣：N2，0.10 MPa；分流進樣，進樣溫度：200℃；FID檢測器，檢測溫度：220℃；氫氣：0.15 MPa；空氣：0.15 MPa；柱溫：120℃～200℃。

采用島津LC-20 AT高效液相色譜儀進行敵百蟲、敵敵畏化學純度分析，敵百蟲分析：Kr o masil-C18柱（46 mm ×150 mm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）＝1∶1；檢測波長：205 n m；流速：1.0 mL／min。

敵敵畏分析：Kro masil C18柱（46 mm ×150 mm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）＝1∶1；檢測波長：211 n m；流速：1.0 mL／min。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

采用紅外、核磁和液質(zhì)聯(lián)用進行結(jié)構(gòu)確定。紅外分析條件：KBr壓片。核磁測試條件：400 Hz，CDCl3溶劑。質(zhì)譜檢測條件：電噴霧（ESI）離子源；采用正離子模式，噴霧電壓3 500 V、鞘氣12 bar、輔助氣5 bar、毛細管溫度275℃、Q1分辨率0.7 a mu。

2 結(jié)果與分析

2.1 同位素標記前體的制備

以甲醇和水為原料進行亞磷酸二甲酯的合成，其反應劇烈，歷程復雜，反應條件對收率影響很大。為提高甲醇的利用率，選擇四因素：溫度（X1），時間（X2），投料比（X3），溶劑量（X4），采用均勻設計進行實驗優(yōu)化，均勻設計結(jié)果列于表1。利用DPS軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)二次多項式逐步回歸分析，得回歸方程：

表1 亞磷酸二甲酯均勻設計結(jié)果Table 1 Unifor m design and experi mental results of di methyl phosphite

Y＝315.527 913 5－121.374 981 86 X3＋14.872 108 925 X3＊X3－0.000 487 692 744 6 X4＊X4－0.730 052 611 8 X2＊X3。

相關(guān)系數(shù)R＝0.099 41，F(xiàn)＝63.501 7，顯著水平P＝0.003 1＜0.05，剩余標準差S＝1.336 4，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)R＝0.986 3，Dur bin-Watson統(tǒng)計量d＝2.550 770 82。說明該方程能很好地擬合亞磷酸二甲酯的合成過程。

經(jīng)過均勻設計得到較優(yōu)的配實驗工藝，其效果需要進行檢驗。本實驗以計算所得最佳工藝條件：溫度69℃，時間0.83 h，投料比3.0，溶劑量19 mL進行實驗驗證，實際收率為84.5%。基本與理論預測值吻合，說明此方程具有較好的指導意義。

2.2 敵百蟲合成工藝選擇

Javidan［26］等，采用微波加熱方式，在 Al2O3催化劑作用下，合成得到敵百蟲，取得較好的效果，參考此方法，并與常規(guī)加熱方式進行對比，控制投料摩爾比n［（Me O）2PH］∶n（三氯乙醛）＝1∶1.05，實驗結(jié)果列于表2。由表2可知，采用常規(guī)加熱方式時，只需適當延長反應時間，其收率也可達到微波加熱反應的水平，同時發(fā)現(xiàn)，當體系中不含催化劑Al2O3時，收率反而有所提高，此現(xiàn)象與文獻［26］結(jié)果有別。最終選擇不使用催化劑反應，初收率達到99%以上。高效液相色譜（HPLC）檢測產(chǎn)品純度為85%，需要進一步分離提純。

表2 敵百蟲合成實驗結(jié)果Table 2Synthetic exploration of trichlorfon

2.3 敵百蟲分離提純

根據(jù)敵百蟲在不同溶劑中的溶解度差別，選擇復合溶劑進行重結(jié)晶。經(jīng)過五次重結(jié)晶實驗后，敵百蟲提純達到101.58%（標樣純度97.0%），經(jīng)校正后，化學純度為98.5%，可以作為內(nèi)標應用。

2.4 堿量對敵敵畏合成的影響

通過敵百蟲堿解的方法合成敵敵畏，堿量大小對敵敵畏收率影響顯著，堿量太少會影響反應速率，而堿量太多則會促進敵敵畏進一步水解生成磷酸二甲酯和二氯乙醛。因此，本實驗在文獻［27］基礎(chǔ)上，通過改變Na OH用量，考察其對合成敵敵畏的影響，實驗結(jié)果列于表3，當Na OH與敵百蟲的摩爾比為1.3∶1時，敵敵畏合成的收率達到81.1%。

表3 堿量對敵敵畏合成的影響Table 3Synthetic opti mization of dichlor ophos s

2.5 豐度實驗

在優(yōu)化條件下，按照豐度實驗投料量，進行了多次驗證實驗，同時對所需實驗裝置進行徹底清洗，避免豐度稀釋。使用CD3OD（氘豐度99.5%）為原料，按照實驗獲得的優(yōu)化條件進行了同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6和敵敵畏－甲氧基-D6的合成。以消耗的CD3OD計算，同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6和敵敵畏－甲氧基-D6的收率分別為總收率為57.7%和47.3%，化學純度均高于98.0%，氘同位素豐度均高于98.0%。

2.6 結(jié)構(gòu)鑒定

合成得到的產(chǎn)品經(jīng)MS、NMR、IR進行結(jié)構(gòu)鑒定。敵百蟲和敵敵畏多級碎片質(zhì)量簡圖示于圖1。

同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6，化學純度為98.5%，氘 同 位 素 豐 度 為 98.4%。LC-MSESI-：［M ＋ H］＋＝ 263、265、267；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ4.52 （d，J＝ 11.9 Hz，1 H）；13C NMR （101 MHz，CDCl3）δ97.65、97.54（1C，C-Cl），δ80.66 -76.69（1C，C-OH），δ 54.28～53.12（2C，C-D）；FT-IR （KBr）ν／c m－1：3 354.9，2 898.6，2 585.0，2 269.8，2 206.6，2 156.4，2 081.1，1 876.2，1 819.3，1 373.9，1 250.8，1 203.7，1 047.9，1 019.4，917.0，835.7，812.5，782.0，710.4，619.5，522.8，468.0，438.0。

同位素標記敵敵畏－甲氧基-D6，化學純度為98.2%，氘 同 位 素 豐 度 為 98.2%。LC-MSESI-：［M＋H］＋＝227、229、231，1H NMR （400 MHz，CDCl3），δ7.00 （d，J＝ 5.3 Hz，1 H）；13C NMR （101 MHz，CDCl3），δ133.65～133.61（1C，C-H），δ113.99～113.85（1C，C-Cl），δ 54.83～53.92（2C，C-D）；FT-IR （KBr）ν／c m－1：3 076.0，2 264.1，2 080.8，1 645.0，1 282.5，1 151.3，1 112.7，1 049.1，972.0，919.0，837.0，806.1，734.8，655.7。

以上數(shù)據(jù)與目標化合物結(jié)構(gòu)式相符，表明所合成的化合物即為目標化合物。

圖1 敵百蟲、敵敵畏多級碎片質(zhì)量簡圖Fig.1 Multistage fragment mass diagram of trichlorf on and dichlorophos

3 討論

在同位素有機合成中，由于同位素原料價格昂貴，因此衡量其合成路線優(yōu)劣的主要因素是同位素原子的利用率、產(chǎn)物的化學純度和同位素豐度，尤其是氘化合物的同位素豐度，易與外界中氫發(fā)生交換，造成豐度稀釋。在合成中，一般選擇待標記分子的骨架或者其穩(wěn)定基團，以避免同位素豐度的稀釋。實驗中，以甲基作為氘原子的引入基團，采用CD3OD作為基礎(chǔ)試劑，選擇合適的反應條件，合成敵百蟲－甲氧基-D6和敵敵畏－甲氧基-D6，并對合成過程中多個關(guān)鍵步驟進行了優(yōu)化，提高了最終產(chǎn)物的純度和收率。

中間體穩(wěn)定同位素標記亞磷酸二甲酯的分子離子峰為m／z＝117、118，說明在合成過程中，甲氧基上6個H被D取代，而合成得到的部分亞磷酸二甲酯分子中P-OD中的D也被環(huán)境中H取代，即合成產(chǎn)品中包含亞磷酸二甲酯－［D6］和亞磷酸二甲酯-［D7］，其比例約為1∶3.9。

目標產(chǎn)物同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6和敵敵畏－甲氧基-D6的分子離子峰與相應的分子式的相對分子質(zhì)量一致，其同位素豐度經(jīng)計算分別為98.4%、98.2%，通過目標產(chǎn)物的二級質(zhì)譜圖，確認了敵百蟲、敵敵畏裂解規(guī)律（見圖1），為目標化合物在食品安全檢測中做內(nèi)標應用奠定了基礎(chǔ)。

在1H NMR譜圖中，－OCH3的特征吸收峰明顯消失，說明目標產(chǎn)物中2個－OCH3中的6個H原子被D原子取代。在同位素標記的敵百蟲1H NMR譜圖中，－OH也同時消失，說明－OH上的H原子也同樣被D原子取代，但在MS譜圖中，顯示只有－OCH3的H被取代，其原因可能是－OD的D原子較活潑，在進行質(zhì)譜測試時，直接發(fā)生交換，變?yōu)槠胀℉原子。在IR譜圖中，目標產(chǎn)物分子式的各官能團的吸收峰都比較明顯。

4 小結(jié)

（1）以同位素標記物CD3OD為標記前體，利用有機合成方法，通過甲基化、堿解等步驟，以良好收率合成出穩(wěn)定同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6和敵敵畏－甲氧基-D6，并有效避免了氘同位素豐度的稀釋。

（2）優(yōu)化合成工藝條件。氘同位素標記敵百蟲－甲氧基-D6總收率為57.7%，氘同位素標記敵敵畏－甲氧基-D6總收率為47.3%。

（3）產(chǎn)品經(jīng)高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）檢測，化學純度大于98.0%，氘同位素豐度高于98.0%，未出現(xiàn)同位素明顯稀釋現(xiàn)象，可作為同位素內(nèi)標應用于食品安全檢測。

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