液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)壯陽(yáng)類(lèi)中成藥中西地那非的含量*

鄧銀華,章為

(1.湖南省人民醫(yī)院藥學(xué)部,長(zhǎng)沙 410005;2.湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究所,長(zhǎng)沙 410001)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)壯陽(yáng)類(lèi)中成藥中西地那非的含量*

鄧銀華1,章為2

(1.湖南省人民醫(yī)院藥學(xué)部,長(zhǎng)沙 410005;2.湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究所,長(zhǎng)沙 410001)

目的 建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測(cè)壯陽(yáng)類(lèi)中成藥中非法添加西地那非含量的方法。方法采用Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動(dòng)相:含0.1%醋酸的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液-乙腈(70∶30),流速為0.2 mL·min-1,柱溫為35℃;質(zhì)譜采用電噴霧離子源,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(正離子),兩通道475→100,475→283。結(jié)果西地那非在0.198 6～1.986 ng內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=27 750X+15 232(r=0.995 2),平均回收率為96.6%,RSD為1.8%(n=9),分析方法的定量下限為0.04 ng,檢測(cè)限為0.01 ng。10批樣品中有4批檢測(cè)出非法添加了西地那非,含量為每次服用量25或50 mg。結(jié)論該方法靈敏度高,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,適用于壯陽(yáng)類(lèi)中成藥中非法添加西地那非的含量檢測(cè)。

西地那非;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

一些不法生產(chǎn)者擅自在中成藥中添加化學(xué)藥成分以達(dá)到壯陽(yáng)類(lèi)藥物快速起效的效果[1-2]。非法添加的化學(xué)成分中可能攜帶制備過(guò)程中未除去的雜質(zhì)[3],并未能通過(guò)有效的方法加以檢出、控制,可能給使用者造成直接或潛在的危害。因此,必須建立完整的違禁藥物監(jiān)測(cè)體系,保證患者的用藥安全。既往研究常采用常規(guī)配備光學(xué)檢測(cè)器的色譜檢測(cè),只能提供相對(duì)保留時(shí)間,難以獨(dú)立確證檢測(cè)結(jié)果[4-10]。筆者在本研究建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)法快速檢測(cè)壯陽(yáng)類(lèi)中成藥中非法添加西地那非含量的方法,以質(zhì)譜儀作為檢測(cè)器的LCMS檢測(cè)系統(tǒng)分析的是化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息,如相對(duì)分子質(zhì)量、特征碎片等,結(jié)果專屬性強(qiáng),定性、定量更準(zhǔn)確。本次實(shí)驗(yàn)共抽檢10批樣品,有4批檢出非法添加枸櫞酸西地那非,報(bào)道如下。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 乙腈(HPLC級(jí),默克公司,批號(hào):1489730-925),乙酸銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):F20120818),水為超純水;枸櫞酸西地那非對(duì)照品(Toronto Reaearch Chemicals Inc.,Cat#S435000,批號(hào):3-ARP-69-1);壯陽(yáng)類(lèi)中成藥10批,均為市售品。

1.2 儀器 Waters Alliance-Quattro Micro液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司),色譜柱為Waters BEH C18鍵合硅膠柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);SB-5200DTN超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司); R200D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司);CH80-2臺(tái)式低速離心機(jī)(上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取枸櫞酸西地那非對(duì)照品9.93 mg,置50 mL量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,取1.0 mL,置50 mL量瓶中,加50%乙腈溶液稀釋至刻度,搖勻,制成3 972 ng·mL-1的儲(chǔ)備液,備用。

2.2 供試品溶液制備 取供試品一次服用量,置于50 mL量瓶中,加乙腈40 mL,超聲提取15 min,放冷至室溫,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液1.0 mL,置50 mL量瓶中,加50%乙腈溶液稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:含0.1%乙酸的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液-乙腈(70∶30);流速: 0.2 mL·min-1;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 模式為電噴霧離子化(Electrospray ionization,ESI)方式,MRM,檢測(cè)離子為正離子,兩通道475→100,475→283。干燥氣流量為500 L·h-1,霧化氣流量為50 L·h-1,電離電壓:3.0 kV;導(dǎo)入電壓: 3 V;離子源溫度:120℃;干燥氣溫度:350℃;碰撞室氣體:氬氣;通道475→100碰撞能量:25 V;通道475→283碰撞能量:33 V。

2.3.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取“2.1”和“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液和供試品溶液,按照“2.3.1”項(xiàng)色譜條件和“2.3.2”質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果LC-MS圖譜見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察和定量下限的確證 用對(duì)照品儲(chǔ)備液配制濃度分別為39.72,79.44,158.88,198.6, 397.2 ng·mL-1的對(duì)照品溶液,分別精密吸取各5 μL,注入LC-MS儀,測(cè)定西地那非MRM 475→100的峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo),色譜峰峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程為Y=27 750X+ 15 232(r=0.995 2),西地那非進(jìn)樣量在0.198 6～1.986 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.04 ng (S/N=15),檢測(cè)限為0.01 ng(S/N=5)。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液5 μL,按“2.3”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)定西地那非色譜峰峰面積,計(jì)算RSD為2.25%(n=5)。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液5 μL,分別于制備后0,2,4,6,8,10,12 h進(jìn)樣,測(cè)定西地那非的色譜峰峰面積,計(jì)算RSD為1.92%。表明溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 取同一已知含量供試品(西地那非未檢出)9份,分別置50 mL量瓶中,分為3批,每批3份,各分別加入39.72,198.60和397.20 ng·mL-1的對(duì)照品溶液5 mL,按“2.2”項(xiàng)方法制得低、中、高3種濃度供試品溶液,分別精密吸取5 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定色譜峰峰面積。將加樣供試品中西地那非峰面積除以相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液峰面積計(jì)算回收率,結(jié)果低、中、高濃度回收率分別為95.8%,95.4%, 98.5%,平均96.6%,RSD=1.8%。

A.對(duì)照品(475→100);B.對(duì)照品(475→283);C.供試品(475→100);D.供試品(475→283)圖1 對(duì)照品和供試品的LC-MS圖A.reference substance(475→100);B.reference substance(475→283);C.sample(475→100);D.sample(475→283)Fig.1 LC-MS chromatogram of reference substance and sample

2.8 耐用性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)中比較3種不同類(lèi)型的色譜柱:Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、WatersHSS C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Agilent ZORBAX C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm),結(jié)果供試品溶液在這3種色譜柱上均能得到很好的結(jié)果。柱溫分別為35和45℃時(shí),供試品溶液均能得到很好的效果。

2.9 樣品含量測(cè)定 取供試品一次服用量,置50 mL量瓶中,按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定西地那非MRM 475→100的峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算樣品中西地那非濃度,進(jìn)一步換算為每次服用量中西地那非的含量。結(jié)果10批樣品中有4批檢測(cè)出非法添加西地那非,含量為每次服用量25或50 mg。

3 討論

中成藥中非法添加的化學(xué)藥成分不但涉嫌不正當(dāng)競(jìng)爭(zhēng),而且其中可能攜帶制備過(guò)程中未除去的雜質(zhì),將給使用者造成直接或潛在的危害。因此,加強(qiáng)中成藥質(zhì)量監(jiān)管,建立準(zhǔn)確有效的違禁藥物檢測(cè)技術(shù),對(duì)保障患者的身體健康具有重要意義。

筆者在本研究建立LC-MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)壯陽(yáng)類(lèi)中成藥中非法添加西地那非的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,樣品中雜質(zhì)對(duì)西地那非無(wú)干擾,樣品峰形良好,并且樣品前處理程序簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,專屬性好,靈敏度高。本方法為打擊壯陽(yáng)類(lèi)中成藥中非法添加西地那非提供良好、可行的技術(shù)支持。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.032

Quantitative Determination of Sildenafil in Aphrodisiacs by LC-MS

DENG Yin-hua1,ZHANG Wei2
(1.Department of Pharmacy,People’s Hospital of Hunan Province,Changsha 410005,China;2.Hunan Institute for Food and Drug Control,Changsha 410001,China)

ObjectiveTo establish a method for the quantitative determination of sildenafil in aphrodisiacs by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).MethodsChromatography was carried on a Waters BEH C18column(50 mm× 2.1 mm,1.7 μm)with the column temperature being 35℃and 0.02 mol·L-1ammonium acetate water solution(containing 0.1%acetic acid)-acetonitril(70∶30)as the mobile phase at a flow rate of 0.2 mL·min-1.Determination was performed by multiple reaction monitoring mode in two channels,475→100,475→283,using electrospray ionization in positive ion mode.ResultsSildenafil had a good linear relationship in the range of 0.1986-1.986 ng with the linear regression equation beingY= 27 750X+15 232(r=0.995 2).The average recovery was 96.6%with RSD being 1.8%(n=9).The limits of quantitation and detection were 0.04 ng and 0.01 ng,respectively.ConclusionThe determination results of 10 batches of samples show that the method is sensitive and accurate and can be used as an appropriate technique to detect sildenafil in aphrodisiacs.

Sildenafil;Liquid chromatography-mass spectrometry;Multiple reaction monitoring

R983;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1373-03

2013-10-27

2014-04-09

*湖南省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(C2012-13)

鄧銀華(1980-),女,湖南邵陽(yáng)人,主管藥師,碩士,研究方向:藥品分析及質(zhì)量控制等。電話:0731-83929301, E-mail:dengyinhua@sina.com。