魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮對(duì)LPS-TLR4/MD-2-TNF-α炎癥通路的影響*

陳婧,王文清,施春陽(yáng),侯小龍,萬(wàn)進(jìn),方建國(guó)

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430030)

魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮對(duì)LPS-TLR4/MD-2-TNF-α炎癥通路的影響*

陳婧,王文清,施春陽(yáng),侯小龍,萬(wàn)進(jìn),方建國(guó)

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430030)

目的 探討魚(yú)腥草揮發(fā)油及其單體甲基正壬酮對(duì)LPS-TLR4/MD-2-TNF-α炎癥通路的影響。方法以TLR4/MD-2阻斷劑封閉TLR4/MD-2位點(diǎn),分別運(yùn)用蛋白免疫印跡法(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)對(duì)魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮干預(yù)后細(xì)胞中TLR4蛋白和炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素10(IL-10)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)建立二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型,對(duì)魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮的體內(nèi)抗炎藥效進(jìn)行比較。結(jié)果在1～10 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)短時(shí)干預(yù)時(shí),魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TLR4蛋白的抑制作用優(yōu)于甲基正壬酮,對(duì)炎癥因子的作用與甲基正壬酮有一定差異。LPS+TLR4/MD-2阻斷劑+藥物干預(yù)組與LPS+TLR4/MD-2阻斷劑組比較,以揮發(fā)油干預(yù)后細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而以甲基正壬酮干預(yù)后細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)明顯減少。表明魚(yú)腥草揮發(fā)油通過(guò)LPS-TLR4/MD-2-TNF-α通路發(fā)揮其抗炎作用,而甲基正壬酮可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮其抗炎作用。在相同劑量下魚(yú)腥草揮發(fā)油的體內(nèi)抗炎活性優(yōu)于甲基正壬酮。結(jié)論魚(yú)腥草揮發(fā)油與甲基正壬酮存在抗炎作用及機(jī)制的差異性,應(yīng)是揮發(fā)油中多成分協(xié)同作用的結(jié)果。

魚(yú)腥草;揮發(fā)油;甲基正壬酮;TLR4/MD-2;炎癥通路

現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道魚(yú)腥草抗炎作用機(jī)制的研究以對(duì)炎癥遞質(zhì)尤其是細(xì)胞因子的影響居多,也涉及細(xì)胞信號(hào)通路、環(huán)氧化酶、基因轉(zhuǎn)錄、下丘腦-垂體-腎上腺軸和某些特定蛋白等方面[1]。盡管目前關(guān)于魚(yú)腥草抗炎作用機(jī)制的研究已達(dá)到細(xì)胞和分子水平,但在基因水平和受體方面的研究仍然不足。有關(guān)揮發(fā)油中活性單體甲基正壬酮作用機(jī)制的研究也較少[2]。TLR4作為T(mén)oll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)家族中最早發(fā)現(xiàn)的亞型之一,可介導(dǎo)針對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的免疫應(yīng)答。在LPS-TLR4信號(hào)通路中,LPS與髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein,MD-2)結(jié)合后,引起TLR4/MD-2復(fù)合物中TLR4的低聚活化,誘導(dǎo)TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3-5],隨后分別激活下游MAPK等通路,作用于不同環(huán)節(jié),從而影響TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的分泌。

魚(yú)腥草揮發(fā)油作為一種多成分的復(fù)合物,其抗炎作用是否優(yōu)于其活性單體,它們發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制是否存在不同?本研究首先通過(guò)TLR4/MD-2阻斷劑封閉TLR4/MD-2位點(diǎn),研究魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響;結(jié)合它們對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-10分泌的影響,探討它們作用于LPS-TLR4/MD-2-TNF-α通路的途徑,同時(shí)采用二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型對(duì)兩者的體內(nèi)抗炎活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)對(duì)魚(yú)腥草揮發(fā)油及其活性單體甲基正壬酮在受體方面作用機(jī)制的探討,以期發(fā)現(xiàn)它們是否存在作用靶點(diǎn)的不同,有望為進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)以魚(yú)腥草為原料的抗炎新藥提供信息。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性清潔級(jí)昆明小鼠,體質(zhì)量20～25 g,購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2010-0009,動(dòng)物合格證號(hào): 4209800221/231。小鼠飼養(yǎng)于控制環(huán)境條件中,溫度(25±2)℃;相對(duì)濕度(70±5)%,以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),使其自由飲水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,小鼠禁食12 h,不禁水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物協(xié)議和指南進(jìn)行。

1.2 試藥與細(xì)胞 TLR4/MD-2阻斷劑(美國(guó)ebioscience公司,批號(hào):E06992-1630),兔抗鼠TLR4抗體(英國(guó)Abcam公司,批號(hào):GR23135-1),辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的內(nèi)參抗體試劑盒(美國(guó)Cell Signaling公司,批號(hào):11/16/12),Marker(美國(guó)Thermo公司,批號(hào):00124777);柯達(dá)X-OMATBT醫(yī)用X射線膠片(批號(hào):031802701),化學(xué)發(fā)光劑(美國(guó)Thermo公司,批號(hào):OC182128);聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國(guó)Roche公司,批號(hào):KZMA8338HK),BCA蛋白測(cè)定試劑盒(武漢啟動(dòng)子生物科技有限公司),RIPA(Radio-Immunoprecipitation Assay)裂解液(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):SLBD5707),顯影液、定影液(武漢谷歌生物科技有限公司,批號(hào): 20131203);RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,批號(hào):20130315);胰酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)消化液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,批號(hào):20130131);LPS(Sigma-Aldrich Biotechnology生產(chǎn),批號(hào):111M4035V),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,HyClone公司,批號(hào): NXC0583);TNF-α、IL-10、IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)試劑盒(美國(guó)eBioscience公司,批號(hào)依次為E09479-1641, E09382-1637,E09323-1639)。甲基正壬酮(美國(guó)ALORICH chemistry,含量99%,批號(hào):MKBJ5580V),聚山梨酯-20,二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide,MTT)均購(gòu)自武漢啟動(dòng)子生物科技有限公司。魚(yú)腥草揮發(fā)油為宜昌產(chǎn)魚(yú)腥草藥材以水蒸氣蒸餾法自提所得,魚(yú)腥草藥材經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部方建國(guó)教授鑒定為三白草科植物蕺菜的新鮮全草。RAW264.7細(xì)胞由武漢博士德生物科技有限公司購(gòu)得。

1.3 儀器 二氧化碳細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(3111型)、超高速冷凍離心機(jī)(Heraeus Multifuge X1R centifuge)、酶標(biāo)儀(1510型)均為美國(guó)Thermo公司生產(chǎn),倒置光學(xué)顯微鏡(CKX41型,日本OLYMPUS公司),超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D型,蘇州凈化設(shè)備有限公司),電泳儀電源(美國(guó)Bio-rad公司,PowerPacTMUniversal Power Supply),電泳槽(JY-SCZ2+型)、轉(zhuǎn)移槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司),脫色搖床(TS-8型,海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司),分析天平(日本SHIMADZU公司,AUW220D型),塑料薄膜封口機(jī)(FS-200型,永康市特力包裝機(jī)械有限公司),X射線攝影暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 Western blot檢測(cè)TLR4蛋白的表達(dá)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 以10%FBS 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶底(25 cm2)的90%時(shí),以胰酶-EDTA消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)·mL-1,將細(xì)胞接種于6孔板中(每孔2 mL),于恒溫二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h (37℃,5%CO2)。繼以0.5%FBS 1640培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞同步化處理24 h后分組,正常對(duì)照組:加新鮮0.5% FBS 1640培養(yǎng)基;LPS模型對(duì)照組:加含LPS 1 μg·mL-1的新鮮0.5%FBS 1640培養(yǎng)基;LPS+藥物干預(yù)組:分別以含1,10 μg·mL-1的魚(yú)腥草揮發(fā)油、甲基正壬酮的新鮮0.5%FBS 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h,棄去含藥物培養(yǎng)基,加含LPS 1 μg·mL-1的新鮮0.5%FBS 1640培養(yǎng)基;LPS+TLR4/MD-2阻斷劑組:以含10 μg·mL-1的TLR4/MD-2阻斷劑的新鮮0.5%FBS 1640培養(yǎng)基預(yù)處理1 h,棄去阻斷劑,加含LPS的新鮮0.5%FBS 1640培養(yǎng)基(LPS濃度為1 μg·mL-1); LPS+TLR4/MD-2阻斷劑+藥物干預(yù)組:以含10 μg·mL-1的TLR4/MD-2阻斷劑的新鮮0.5%FBS 1640培養(yǎng)基預(yù)處理1h,棄去阻斷劑,加含10 μg·mL-1魚(yú)腥草揮發(fā)油、甲基正壬酮的新鮮0.5% FBS 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h,棄去含藥物培養(yǎng)基,加含LPS 1 μg·mL-1新鮮0.5%FBS 1640培養(yǎng)基。

1.4.2 細(xì)胞總蛋白提取與測(cè)定 照上述分組處理完畢2 h后,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)潤(rùn)洗培養(yǎng)板3次。將培養(yǎng)板于4℃傾斜放置0.5 h,吸去殘余PBS,收集細(xì)胞。于冰上加RIPA裂解液,每孔50 μL,4℃平置0.5 h,將細(xì)胞刮下,轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中。以超高速低溫離心機(jī)離心15 min, 4℃,12 000 r·min-1(有效離心半徑9.64 cm),取上清液至新的預(yù)冷EP管中,-20℃保存。

照BCA蛋白測(cè)定試劑盒操作,繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品的A562值扣去空白,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.4.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)樣品的蛋白濃度和上樣量確定合適上樣體積,分別加5%的5×SDS和適量DDH2O,95～100℃水浴5 min使其變性,冷卻后放置于冰上。上樣后以恒定電壓80 V電泳3～3.5 h,至溴酚藍(lán)條帶到達(dá)下部膠底部時(shí)停止電泳。以恒定電流300 mA,4℃條件下轉(zhuǎn)膜2 h。將膜取出后置封閉液(含3%血清的TBST)中室溫振搖封閉1 h。根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量將PVDF膜分段剪下,以TLR4抗體(1∶1 000)封膜,小心趕走氣泡,于4℃放置過(guò)夜。次日將膜取出后以TBST洗脫5或6次,每次6～8 min,置加有適量HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)的培養(yǎng)皿中室溫振搖孵育2 h,以TBST洗膜5或6次,每次6～8 min。加電化學(xué)發(fā)光劑(electrochemiluminescence, ECL)后壓片,顯影定影后運(yùn)用IamgeJ軟件以灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.5 TNF-α等細(xì)胞因子檢測(cè) 以ELISA法檢測(cè)藥物干預(yù)后對(duì)細(xì)胞因子分泌水平的影響。RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)·mL-1密度接種于96孔板,每孔200 μL,于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行抗體包被,配制清洗緩沖液(含0.5%聚山梨酯20的PBS溶液)。以PBS配制LPS溶液,使其終濃度為1 μg·mL-1。配制藥物儲(chǔ)備液濃度為50 mg·mL-1,以PBS逐級(jí)稀釋,使其終濃度分別為0.1,1,10,20 μg·mL-1。分為正常對(duì)照組(培養(yǎng)液40 μL)、LPS模型對(duì)照組(培養(yǎng)液、LPS各20 μL)、藥物干預(yù)組(不同濃度的藥液、LPS各20 μL),培養(yǎng)過(guò)夜。次日取細(xì)胞上清液以PBS稀釋20倍,每孔100 μL加入已包被抗體的96孔板,每組4個(gè)復(fù)孔。余操作按照試劑盒說(shuō)明。

1.6 體內(nèi)抗炎藥效實(shí)驗(yàn) 分別將魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮給小鼠灌胃(灌胃量100 mg·kg-1),正常對(duì)照組給予同等體積的聚山梨酯-80(2%,灌胃樣品溶劑),陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予阿司匹林100 mg·kg-1,每組10只。末次給藥后1 h,于小鼠右耳正反兩面均勻涂布二甲苯20 μL。左耳不做任何處理。30 min后將小鼠脫頸椎處死,用電子耳腫打孔器在左右雙耳相同位置處打下圓片(直徑8 mm)。及時(shí)稱定質(zhì)量,以雙耳的質(zhì)量差異來(lái)衡量耳腫脹的程度。耳腫脹抑制率(%)=(正常對(duì)照組耳腫脹度-藥物組耳腫脹度)/正常對(duì)照組耳腫脹度×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響 在LPS誘導(dǎo)后, RAW264.7細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01),LPS+藥物干預(yù)組中TLR4蛋白的表達(dá)均低于LPS模型組(P＜0.05),魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮在高濃度(10 μg·mL-1)時(shí)對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響較低濃度(1 μg·mL-1)時(shí)明顯,同時(shí)高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。在1～10 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)短時(shí)干預(yù)時(shí),魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)TLR4蛋白的抑制作用優(yōu)于甲基正壬酮。以TLR4/MD-2阻斷劑阻斷TLR4/MD-2位點(diǎn)后,顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)(P＜0.01);在阻斷TLR4/MD-2位點(diǎn)的基礎(chǔ)上再加藥物干預(yù)后,TLR4蛋白的表達(dá)與LPS+ TLR4/MD-2阻斷劑組、LPS+藥物干預(yù)組相比均有所下降,同時(shí)均低于LPS模型對(duì)照組中TLR4蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。LPS+TLR4/MD-2阻斷劑+藥物干預(yù)組與LPS+TLR4/MD-2阻斷劑組比較,以揮發(fā)油干預(yù)后細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而以甲基正壬酮干預(yù)后細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)明顯減少。結(jié)果表明,魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá),揮發(fā)油的這種作用可能是通過(guò)阻斷TLR4/MD-2靶點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的,且呈一定的劑量依賴性。而甲基正壬酮可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮其抗炎作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-10分泌的影響 與正常對(duì)照組比較,LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后,TNF-α、IL-1β、IL-10的分泌顯著增加(P＜0.05),魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮在0.1～20.0 μg·mL-1范圍內(nèi)均能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的分泌(P＜0.01或P＜0.05),同時(shí)增加IL-10的分泌(P＜0.05),且與濃度呈正相關(guān)。在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi),魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)IL-1β分泌的抑制作用略優(yōu)于甲基正壬酮,對(duì)TNF-α的抑制作用不及甲基正壬酮,而對(duì)IL-10的作用和甲基正壬酮相當(dāng)(P＞0.05)。以20 μg·mL-1濃度作用于細(xì)胞時(shí),魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)TNF-α的抑制作用顯著優(yōu)于甲基正壬酮(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.正常對(duì)照組;2.LPS模型對(duì)照組;3.LPS+魚(yú)腥草揮發(fā)油(10 μg·mL-1)組;4.LPS+甲基正壬酮(10 μg·mL-1)組;5. LPS+TLR4/MD-2組;6.LPS+TLR4/MD-2+魚(yú)腥草揮發(fā)油(10 μg·mL-1)組;7.LPS+TLR4/MD-2+甲基正壬酮(10 μg·mL-1)組;8.LPS+魚(yú)腥草揮發(fā)油(1 μg·mL-1)組;9. LPS+甲基正壬酮(1 μg·mL-1)組;與正常對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與LPS模型對(duì)照組比較,*2P＜0.01,*3P＜0.05圖1 魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)的影響1.Normal control group;2.LPS model group;3.LPS plus volatile oil from Houttuynia Cordata Thunb.(10 μg·mL-1) group;4.LPS plus 2-undecanone(10 μg·mL-1)group;5.LPS plus TLR4/MD-2 group;6.LPS plus TLR4/MD-2 and volatile oil from Houttuynia Cordata Thunb.(10 μg·mL-1)group;7.LPS plus TLR4/MD-2 and 2-undecanone(10 μg·mL-1)group;8.LPS plus volatile oil from Houttuynia Cordata Thunb.(1 μg·mL-1) group;9.LPS plus 2-undecanone(1 μg·mL-1)group.Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with LPS model group,*2P＜0.01,*3P＜0.05Fig.1 Effects of volatile oil and 2-Undecanone from Houttuynia Cordata Thunb.on TLR4 protein expression in LPS-induced RAW264.7 cells

2.3 體內(nèi)抗炎藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果 灌胃量同為100 mg·kg-1時(shí),盡管給藥組小鼠的耳腫脹抑制率均低于陽(yáng)性對(duì)照組(36.4%),魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)小鼠耳腫脹的抑制率(23.3%)高于甲基正壬酮(17.9%),其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

1.正常對(duì)照組;2.LPS模型對(duì)照組;3.LPS+甲基正壬酮(0.1 μg·mL-1)組;4.LPS+甲基正壬酮(1 μg·mL-1)組;5.LPS+甲基正壬酮(10 μg·mL-1)組;6.LPS+甲基正壬酮(20 μg·mL-1)組;7.LPS+魚(yú)腥草揮發(fā)油(0.1 μg·mL-1)組;8.LPS+魚(yú)腥草揮發(fā)油(1 μg·mL-1)組;9.LPS+魚(yú)腥草揮發(fā)油(10 μg·mL-1)組;10.LPS+魚(yú)腥草揮發(fā)油(20 μg·mL-1)組;與正常對(duì)照組比較,*1P＜0.01,*4P＜0.05;與LPS模型對(duì)照組比較,*2P＜0.05,*3P＜0.01圖2 魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響1.Normal control group;2.LPS model group;3.LPS plus 2-undecanone(0.1 μg·mL-1)group;4.LPS plus 2-undecanone (1 μg·mL-1)group;5.LPS plus 2-undecanone(10 μg·mL-1)group;6.LPS plus 2-undecanone(20 μg·mL-1)group;7.LPS plus volatile oil from Houttuynia Cordata Thunb.(0.1 μg·mL-1)group;8.LPS plus volatile oil from Houttuynia Cordata Thunb. (1 μg·mL-1)group;9.LPS plus volatile oil from Houttuynia Cordata Thunb.(10 μg·mL-1)group;10.LPS plus volatile oil from Houttuynia Cordata Thunb.(20 μg·mL-1)group;Compared with normal control group,*1P＜0.01,*4P＜0.05;Compared with LPS model group,*2P＜0.01,*3P＜0.01Fig.2 Effects of volatile oil and 2-Undecanone from Houttuynia Cordata Thunb.on cytokine production in LPS-induced RAW264.7 cells

體內(nèi)抗炎藥效實(shí)驗(yàn)及其體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,魚(yú)腥草揮發(fā)油和甲基正壬酮均可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá),并影響下游TNF-α、IL-1β、IL-10等細(xì)胞因子的分泌,從而發(fā)揮其抗炎作用。在1～10 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)短時(shí)干預(yù)時(shí),魚(yú)腥草揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞中TLR4蛋白的抑制作用優(yōu)于甲基正壬酮,且魚(yú)腥草揮發(fā)油在相同劑量下的體內(nèi)抗炎活性也優(yōu)于后者;但對(duì)細(xì)胞因子的作用并不絕對(duì)優(yōu)于甲基正壬酮,在中低濃度時(shí)對(duì)IL-1β等炎癥因子的影響與甲基正壬酮比較略優(yōu)或相當(dāng),而在高濃度時(shí)對(duì)TNF-α分泌的抑制作用顯著優(yōu)于甲基正壬酮,應(yīng)與其作用濃度與時(shí)間均相關(guān)。對(duì)LPS-TLR4/MD-2通路的研究結(jié)果表明,魚(yú)腥草揮發(fā)油通過(guò)阻斷TLR4/MD-2位點(diǎn)發(fā)揮其抗炎作用,而甲基正壬酮可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮其作用。經(jīng)檢測(cè),魚(yú)腥草揮發(fā)油中所含甲基正壬酮僅為330.5 mg·g-1[6],在同等給藥劑量下,即給予100 mg·kg-1揮發(fā)油灌胃后,進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的甲基正壬酮僅為33.05 mg·kg-1,但揮發(fā)油的體內(nèi)抗炎活性優(yōu)于甲基正壬酮,表明魚(yú)腥草揮發(fā)油發(fā)揮體內(nèi)抗炎藥效及其對(duì)LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響是多成分協(xié)同作用的結(jié)果。

目前魚(yú)腥草抗炎作用機(jī)制研究的對(duì)象主要集中在不同的溶劑提取物,如水提物、乙醇提取物等。中藥提取物為多種成分的粗制劑,含有一些特定成分和其他生物活性物質(zhì),使其發(fā)揮藥理作用分子機(jī)制的研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用受到較大的限制。開(kāi)展中藥及其單體成分的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用特點(diǎn)、作用機(jī)制等系統(tǒng)、深入的綜合性研究工作,可以為成分明確的新型抗炎藥物的研發(fā)開(kāi)辟新途徑。因此,通過(guò)對(duì)魚(yú)腥草提取物尤其是其有效單體抗炎作用機(jī)制的研究,有望為進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)以魚(yú)腥草為原料的抗炎新藥提供依據(jù)。

[1] 陳婧,方建國(guó),吳方建,等.魚(yú)腥草抗炎藥理作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中草藥,2014,45(2):284-289.

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.007

Effects of Volatile Oil and 2-Undecanone from Houttuynia Cordata Thunb.on LPS-TLR4/MD-2-TNF-α Inflammation Signaling Pathway

CHEN Jing,WANG Wen-qing,SHI Chun-yang,HOU Xiao-long,WAN Jin,FANG Jian-guo
(Department of Pharmacy,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Houttuynia cordataThunb.;Volatile oil;2-Undecanone;TLR4/MD-2;Inflammation signal pathway

R285

A

1004-0781(2014)10-1283-06

2014-04-05

2014-06-10

*湖北省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研重點(diǎn)項(xiàng)目(2012Z-Z05)。

陳婧(1980-),女,湖北武漢人,主管藥師,博士,研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。電話:027-83649095,E-mail:cj8004@163.com。

方建國(guó)(1965-),男,主任藥師,博士生導(dǎo)師,研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。電話:027-83649095,E-mail:fjg3560@sina.com。

ABSTRACT ObjectiveTo explore the effects of volatile oil and 2-undecanone fromHouttuynia CordataThunb.(H. cordata)on LPS-TLR4/MD-2-TNF-α signaling pathway.MethodsTLR4/MD-2 blocking agent was used to mask the TLR4/ MD-2 site,then protein expression levels of TLR4 in cells treated with volatile oil and 2-undecanone were analyzed by western blot.ELISA was used to detect the secretion of the inflammatory cytokines such as TNF-α,IL-1β and IL-10.Comparison analysis was then performed from the results of cell experimentsin vitroand anti-inflammatory effects through xylene-induced ear edema testin vivo.ResultsIn concentrations between 1 to 10 μg·mL-1,Houttuynia volatile oil showed better effect than 2-undecanone on inhibition of TLR4 protein in LPS-induced RAW264.7 cells,and had some differences in the effects on inflammatory factors.Compared with the LPS+TLR4/MD-2 group,the LPS+TLR4/MD-2+volatile oil group had no significant difference in the expression of TLR4 protein(P＞0.05),but the LPS+TLR4/MD-2+2-undecanone group reduced the expression of TLR4 protein obviously.It appeared that volatile oil exerts its anti-inflammatory effect through LPS-TLR4/MD-2-TNF-α pathway,but 2-undecanone may exert its anti-inflammatory effect by other means.Houttuynia volatile oil showed better antiinflammatory activity than 2-undecanonein vivoat the same dose.ConclusionThere are some differences in anti-inflammatory effects and related mechanisms between volatile oil and 2-undecanone,probably owing to the synergistic effects of multiingredients in the volatile oil.