苯磺酸氨氯地平印跡聚合物的合成、性能及應(yīng)用

許文靜，張文生，張社利

（焦作師范高等?？茖W(xué)校 理工學(xué)院，河南 焦作 454000）

苯磺酸氨氯地平（化學(xué)名為3-乙基-5-甲基-2-（2-氨乙氧甲基）-4-（2-氯苯基）-1，4-二氫-6-甲基-3，5-吡啶二羧酸酯苯磺酸鹽）為第三代雙氫吡啶類鈣拮抗劑，因其具有服藥量低、藥效維持時(shí)間長(zhǎng)、不良反應(yīng)少和保護(hù)靶器官等優(yōu)點(diǎn)，是理想的長(zhǎng)效降壓藥物，也是目前臨床上治療冠心病和高血壓的重要藥物［1-2］。

常用的分離檢測(cè)苯磺酸氨氯地平的方法包括：高效液相色譜法［3］、紫外分光光度法［4］、反相高效液相色譜法［5］和高效毛細(xì)管電泳法［6］等，其中高效液相色譜法是分離檢測(cè)苯磺酸氨氯地平的標(biāo)準(zhǔn)方法。對(duì)于生物試樣（如血漿等），常用萃取法提取其中的目標(biāo)物進(jìn)行測(cè)定，但該方法耗費(fèi)溶劑較多、對(duì)環(huán)境有污染且測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)［7］。

分子印跡聚合物是一種人工合成的以待分離分子為模板、具有分子識(shí)別功能的聚合物［8-10］，具有結(jié)構(gòu)預(yù)定性、分子識(shí)別性、穩(wěn)定性好及使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在生物活性物質(zhì)、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染物等的選擇性富集、分離和檢測(cè)方面有廣泛的應(yīng)用前景［11-13］。

本工作以苯磺酸氨氯地平為模板分子、丙烯酸（AA）為單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，利用本體聚合法合成了苯磺酸氨氯地平印跡聚合物（MIPs）。利用FTIR、SEM和靜態(tài)吸附等方法分析了MIPs的結(jié)構(gòu)及吸附性能，并將其作為分散劑應(yīng)用于血漿中苯磺酸氨氯地平的富集分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

苯磺酸氨氯地平：純度大于98%，常州瑞明藥業(yè)有限公司；AA：分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司；EGDMA：分析純，廣州雙鍵貿(mào)易有限公司；偶氮二異丁腈（AIBN）：分析純，廣州化學(xué)試劑公司；氯仿、丙酮、甲醇、乙酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Quonxe 2000 型掃描電子顯微鏡：FEI公司；LC-20AT型液相色譜儀：島津公司；Lambda 35型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、Spectrum 100型傅里葉變換紅外光譜儀：PE公司；RFJ型小型安培瓶熔封機(jī)，吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠。

1.2 本體聚合合成MIPs

取苯磺酸氨氯地平0.567 1 g（1 mmol）溶于10 mL氯仿溶劑中，加入AA 0.274 5 g（4 mmol），振蕩60 min；再分別加入交聯(lián)劑EGDMA 3.76 mL（20 mmol）和AIBN 0.035 0 g，超聲振蕩20 min后通入氮?dú)?，熔封；然后置?0 ℃水浴中振蕩恒溫反應(yīng)24 h；所得塊狀聚合物經(jīng)粉碎后篩分，置于索氏抽提器中用甲醇與乙酸的混合溶液（體積比9∶1）抽提洗滌，直至抽提液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)無(wú)分子吸收；最后用甲醇將聚合物洗滌至中性，用丙酮反復(fù)沉降，除去過(guò)細(xì)粒子，80 ℃下真空干燥24 h即得到MIPs。

非印跡聚合物（NIPs）的制備按上述方法進(jìn)行，但不加苯磺酸氨氯地平。

1.3 分析方法

用傅里葉變換紅外光譜儀分析MIPs和NIPs的結(jié)構(gòu)，KBr壓片；用掃描電子顯微鏡對(duì)真空干燥后的MIPs和NIPs的表面形貌進(jìn)行觀察。HPLC分析以Inertsil DOS-SP（4.6 mm×150 mm×5 μm）為分離柱，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水的混合物（體積比為70∶22∶8），流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.4 MIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附性能研究

1.4.1 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

稱取0.5 g MIPs或NIPs，加入質(zhì)量濃度為200 mg/L的苯磺酸氨氯地平水溶液，在25 ℃恒溫?fù)u床中密閉振蕩24 h，從振蕩開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在1，5，15，30 min 及1，3，5，7，9 h時(shí)抽取吸附液，離心分離，取上清液，用紫外分光光度計(jì)在237 nm處測(cè)定吸光度，考察MIPs或NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平分子的吸附動(dòng)力學(xué)。

1.4.2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

精確稱取50 mg MIPs和NIPs各10份，置于150 mL磨口錐形瓶中，分別加入50 mL不同質(zhì)量濃度的苯磺酸氨氯地平水溶液，在25 ℃恒溫?fù)u床中密閉振蕩24 h后，離心分離，取上清液于237 nm 處測(cè)定其吸光度。吸附量（Q）計(jì)算公式如下：

式中，ρ0為苯磺酸氨氯地平初始質(zhì)量濃度，mg/L；ρe為苯磺酸氨氯地平平衡質(zhì)量濃度，mg/L；V為溶液體積，L；m為MIPs或NIPs的質(zhì)量，g；M為苯磺酸氨氯地平的相對(duì)分子質(zhì)量，567.05；Q1為摩爾吸附量，μmol/g；Q2為質(zhì)量吸附量，mg/g。

1.5 MIPs用作固相分散劑

按文獻(xiàn)［7］報(bào)道的方法制備血漿，然后準(zhǔn)確移取0.5 mL血漿于50 mL燒杯中，加入一定量的苯磺酸氨氯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，再加入0.5 g MIPs，充分?jǐn)嚢枭鲜龌旌衔?，使待測(cè)血漿和苯磺酸氨氯地平均勻分散在MIPs中并自然風(fēng)干形成固相基質(zhì)。在5 mL的注射器中，下端墊一層濾紙，將上述固相基質(zhì)裝入，并輕輕敲實(shí)，上面加蓋一層濾紙，壓緊。用4 mL正己烷分2次洗滌燒杯和玻璃棒并將洗滌液淋洗注射器，棄去淋出液。再用4 mL甲醇分2次洗滌燒杯和玻璃棒并用洗滌液洗脫注射器，然后用2 mL甲醇洗脫注射器。收集3次洗脫液，濃縮至干后，溶于1.0 mL甲醇-乙腈-水的混合物（體積比為70∶22∶8）中，進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 FTIR的表征結(jié)果

MIPs和NIPs的FTIR譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 MIPs和NIPs的FTIR譜圖Fig.1 FTIR spectra of MIPs and NIPs.

從圖1可看出，2 991 cm-1處的吸收峰歸屬于C—H鍵的伸縮振動(dòng)；1 479，1 392 cm-1處的吸收峰歸屬于C—H鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)；1 265，1 166 cm-1處的吸收峰歸屬于C—O鍵的伸縮振動(dòng)。NIPs的FTIR譜圖中，歸屬于C—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在3 565 cm-1處；歸屬于鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在1 732 cm-1處。而在MIPs的FTIR譜圖中，上述吸收峰分別移至3 454 cm-1和1 700 cm-1處，峰形與NIPs相比略有變化。表征結(jié)果顯示，MIPs和NIPs的吸收峰具有相似的峰型和基本相同的峰位置，說(shuō)明苯磺酸氨氯地平分子與AA和EGDMA分子之間的作用力為分子間作用力和氫鍵。

2.2 MIPs的形態(tài)分析

MIPs和NIPs的SEM照片見(jiàn)圖2。從圖2可看出，兩者均具有不規(guī)則形貌的特征，這是由于制作過(guò)程中的粉碎研磨導(dǎo)致的。從圖2a可看出，MIPs表面突起多而明顯。對(duì)比圖2c和d可看出，MIPs的表面粗糙，孔穴多而大；而NIPs的表面較致密，孔穴少而小。表征結(jié)果顯示，在MIPs中形成了與苯磺酸氨氯地平分子相匹配的立體孔穴。這種帶有苯磺酸氨氯地平分子印跡的立體孔穴有利于提高吸附性能，從而提高了MIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附性和選擇性。

圖2 MIPs和NIPs的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of MIPs and NIPs.

2.3 MIPs的吸附動(dòng)力學(xué)

MIPs和NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖3。由圖3可知，MIPs和NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附量均在起始階段迅速增加，MIPs在前15 min內(nèi)的吸附量即達(dá)到292 μmol/g，為平衡吸附量的97%，接近吸附平衡狀態(tài)；NIPs在15 min內(nèi)的吸附量達(dá)到215 μmol/g，為平衡吸附量的90%，也接近吸附平衡狀態(tài)。MIPs比NIPs的吸附量提高了36%，說(shuō)明MIPs比NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附量大、吸附平衡時(shí)間稍短、吸附性能好。

圖3 MIPs和NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Adsorption kinetics curves of amlodipine besylate on MIPs and NIPs.

2.4 MIPs的吸附等溫線及Scatchard分析

MIPs和NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附等溫線見(jiàn)圖4。從圖4可看出，隨苯磺酸氨氯地平初始質(zhì)量濃度從40 mg/L增至220 mg/L，MIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附量從32.2 mg/g增至124.2 mg/g，而NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附量從22.9 mg/g增至96.6 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附量明顯高于NIPs。這是因?yàn)椋谟≯E過(guò)程中苯磺酸氨氯地平分子在MIPs中留下了與之空間結(jié)構(gòu)相匹配的具有多重作用點(diǎn)的立體空穴，這種空穴對(duì)苯磺酸氨氯地平具有高度親和力和特異識(shí)別性，而NIPs中功能團(tuán)的分布是任意的，沒(méi)有形成與苯磺酸氨氯地平分子在空間結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)的分子識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)苯磺酸氨氯地平?jīng)]有特異選擇性。

圖4 MIPs與NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附等溫線Fig.4 Adsorption isotherms of amlodipine besylate on MIPs and NIPs.

為考察M I P s表面位點(diǎn)的分布特征，用Scatchard等溫吸附模型分析了MIPs的吸附等溫線（見(jiàn)式（3））：

式中，KD為親和位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)；Qmax為最大表觀吸附量，mg/g。

苯磺酸氨氯地平在MIPs上的 Scatchard 吸附等溫線見(jiàn)圖5。從圖5可看出，Q/ρe～Q呈2條斜率不同的直線，說(shuō)明MIPs中主要存在2種不同類型的親和位點(diǎn)。由斜率和截距可求得這2種親和位點(diǎn)的KD和Qmax：高親和位點(diǎn)的KD1=129.70 mg/L，Qmax1=309.49 mg/g；低親和位點(diǎn)的KD2=8.56 mg/L，Qmax2=71.39 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MIPs表面2種親和位點(diǎn)對(duì)苯磺酸氨氯地平的最大表觀吸附量分別為309.49 mg/g和71.39 mg/g。

圖5 苯磺酸氨氯地平在MIPs上的 Scatchard 吸附等溫線Fig.5 Scatchard adsorption isotherms of amlodipine besylate on MIPs.

2.5 MIPs富集分離血漿中苯磺酸氨氯地平

利用MIPs分散劑將含苯磺酸氨氯地平的血漿制成固相基質(zhì)，經(jīng)前處理后可在HPLC上檢測(cè)血漿中的苯磺酸氨氯地平的含量。分散劑處理后血漿的HPLC譜圖見(jiàn)圖6。從圖6可看出，保留時(shí)間為3.9 min的吸收峰歸屬于苯磺酸氨氯地平。以MIPs為分散劑時(shí)苯磺酸氨氯地平的加標(biāo)回收率為95.4%，而以NIPs為分散劑時(shí)的加標(biāo)回收率較低，血漿中的雜質(zhì)不會(huì)干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定。對(duì)圖6中B譜線的峰面積積分，得線性回歸方程y=23 022.1x-5.731，線性范圍0.5～20.0 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.4%，最低檢測(cè)限0.5 μg/L，定量限為1.7 μg/L，符合生物試樣的分析要求。應(yīng)用結(jié)果表明，MIPs可對(duì)血漿中的苯磺酸氨氯地平進(jìn)行有效地富集分離，且溶劑用量少，加標(biāo)回收率高，操作簡(jiǎn)單易行。

圖6 分散劑處理后血漿的HPLC譜圖Fig.6 HPLC analysis of blood plasma after treatment with dispersants.

3 結(jié)論

1）以苯磺酸氨氯地平為模板分子、AA為單體、EGDMA為交聯(lián)劑，采用本體聚合法合成了MIPs。MIPs具有與苯磺酸氨氯地平分子相匹配的孔穴，且孔穴中含有與苯磺酸氨氯地平空間結(jié)構(gòu)相匹配的識(shí)別位點(diǎn)，從而增加了MIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附性和選擇性。

2）MIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附量比NIPs對(duì)苯磺酸氨氯地平的吸附量提高了36%。MIPs表面存在2種不同性質(zhì)的親和位點(diǎn)，對(duì)苯磺酸氨氯地平的最大表觀吸附量分別為309.49 mg/g和71.39 mg/g。

3）MIPs可對(duì)血漿中的苯磺酸氨氯地平進(jìn)行有效地富集分離，加標(biāo)回收率95.4%，血漿中的雜質(zhì)不會(huì)干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定，最低檢測(cè)限0.5 μg/L，定量限為1.7 μg/L，符合生物試樣的分析要求，且溶劑用量少，操作簡(jiǎn)單易行。

［1］Rosenthal T，Gavras I. Fixed-Drug Combinations as First-Line Treatment for Hypertension［J］. Prog Cardiovasc Dis，2006，48（6）：416 - 425.

［2］Julius S，Kjeldsen S E，Weber M，et al. Outcones in Hypertensive Patients at High Cardiovascular Risk Treated with Regimens Based on Valsartan or Amlodipine：The VALUE Randomized Trial［J］. Lancet，2004，363（9426）：2022 -2031.

［3］賴可，晁若冰，李楠，等. HPLC測(cè)定復(fù)方氨氯地平膠囊的含量［J］. 華西藥學(xué)雜志，2010，25（6）：748 - 749.

［4］Rahman N，Singh M，Hoda M N. Application of Oxidants to the Spectrophotometric Determination of Amlodipine Besylate in Pharmaceutical Formulations［J］. Ⅱ Farmaco，2004，59（11）：913 - 919.

［5］胡在林. 反相高效液相色譜法測(cè)定苯磺酸氨氯地平膠囊的含量和有關(guān)物質(zhì)［J］. 中國(guó)藥業(yè)，2011，20（12）：28 - 29.

［6］李志偉，趙云超，齊建敏. 高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定纈沙坦苯磺酸氨氯地平［J］. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，32（2）：149 - 153.

［7］王悅.苯磺酸氨氯地平分散片健康人體藥動(dòng)學(xué)和相對(duì)生物利用度研究［D］. 鄭州：鄭州大學(xué)，2007.

［8］Han M，Kane R，Goto M，et al. Discriminate Surface Molecular Recognition Sites on a Microporous Substrate：A New Approach［J］. Macromolecules，2003，36（12）：4472 - 4477.

［9］Iberer G，Hahn R，Jungbauer A. Monoliths as Stationary Phases for Separating Biopolymers：Fourth-Generation Chromatography Sorbents［J］. LC GC，1999，17（11）：998 - 1005.

［10］Ma Yue，Zhang Ying，Zhao Man，et al. Eff i cient Synthesis of Narrowly Dispersed Molecularly Imprinted Polymer Microspheres with Multiple Stimuli-Responsive Template Binding Properties in Aqueous Media［J］. Chem Commun，2012（48）： 6217 - 6219.

［11］Poole C F. New Trends in Solid-Phase Extraction［J］. TrAC Trends Anal Chem，2003，22（6）：362 - 373.

［12］Pichon V，Haupt K. Affinity Separations on Molecularly Imprinted Polymers with Special Emphasis on Solid Phase Extraction［J］. J Liq Chromatogr Related Technol，2006，29（7/8）：989 - 1023.

［13］黃紅萍，游勇基. 分子印跡固相萃取-液相色譜法測(cè)定喘息靈膠囊中鹽酸克侖特羅的含量［J］. 藥物分析雜志，2012，32（2）：233 - 236.