三白草提取物對(duì)自由基的清除作用研究

劉曉欣，曹光群，劉學(xué)

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122)

自從Dan Harman提出衰老的自由基學(xué)說(shuō)和Me.Cord首先發(fā)現(xiàn)SOD并成功提取以來(lái)，研究人員開(kāi)始關(guān)注自由基清除劑類(lèi)皮膚抗衰老化妝品的研制和應(yīng)用。這類(lèi)化妝品能夠預(yù)防、減輕或延緩自由基對(duì)皮膚造成的老化作用，同時(shí)也深受廣大消費(fèi)者的喜歡。按照目前國(guó)際通用分類(lèi)方法，將自由基清除劑分為兩大類(lèi)，即小分子和大分子自由基清除劑。除此之外，還有從植物中提取分離得到的具有自由基清除作用的活性物質(zhì)，如某些黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、蔥醌類(lèi)及茶多酚類(lèi)的化合物。因此，從植物中尋找安全有效的天然抗氧化劑也是目前重要的研究課題之一。

三白草為三白草科多年生草本植物，別名塘邊藕、白花蓮等。三白草生于溝旁、沼澤等低濕處，主產(chǎn)江蘇、浙江等地，我國(guó)長(zhǎng)江流域以南各省均有分布。三白草資源豐富，四季均可采。以全草入藥，具有利尿消腫，清熱解毒之功效，也可用于小便不利、淋瀝澀痛、白帶異常、外治瘡瘍腫毒和濕疹等［1-2］。三白草主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、木脂素類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)化合物［3］，具有明顯的降糖、抑瘤、抗炎、保肝以及抗氧化等作用［4-6］。

本實(shí)驗(yàn)采用三種方法，考察了三白草乙醇提取物經(jīng)不同溶劑萃取所得的各部分對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的清除能力，以BHT為參考。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三白草乙醇提取物經(jīng)不同溶劑萃取所得的各部分對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基都具有清除能力，且隨著提取物濃度增加，清除能力逐漸增高;其中所得的乙酸乙酯萃取部分對(duì)這3種自由基的清除作用最強(qiáng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三白草，購(gòu)自無(wú)錫中藥店;乙醇、石油醚(60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、焦性沒(méi)食子酸(鄰苯三酚)、六水合硫酸亞鐵銨、濃鹽酸、鄰二氮菲、過(guò)氧化氫均為分析純;DPPH、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為生物試劑;BHT，化學(xué)純。

DFY-300型300 g搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī);SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵;W201型恒溫水浴鍋;“弘祥隆”CTXNW-2B型超聲循環(huán)提取機(jī);TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三白草有效成分的提取 稱取三白草粉末100 g，按料液比加入70%乙醇溶液1.8 L，于50℃超聲提取50 min，抽濾，減壓回收溶劑，真空干燥，得三白草乙醇提取物粉末。

1.2.2 三白草溶劑萃取物的制備 將三白草乙醇提取物粉末溶于去離子水，得到水懸液，搖勻，倒入500 mL分液漏斗中。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行多次萃取。各萃取部分的溶液再經(jīng)減壓蒸餾，回收各萃取劑，從而分別得到各萃取部分的濃縮物。各濃縮物用70%乙醇配制成不同濃度的溶液，備用。

1.3 清除自由基能力測(cè)定

1.3.1 清除DPPH自由基的能力測(cè)定［7］用無(wú)水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將2 mL無(wú)水乙醇溶液及2 mL DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處?kù)o置30 min，測(cè)定其吸光度A0，同樣的方法，測(cè)定2 mL DPPH溶液與2 mL待測(cè)樣品溶液(或BHT溶液)混合后的吸光度A1，以及2 mL測(cè)試樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度 A2。

1.3.2 清除羥基自由基的能力測(cè)定［8］實(shí)驗(yàn)中取8支試管，編號(hào)1～8。先向1～8號(hào)試管中，依次加入0.3 mL 鄰二氮菲溶液(濃度 7.5 mmol/L)、1 mL Tris-HCl緩沖劑(pH=7.47)和0.3 mL 硫酸亞鐵銨溶液(濃度7.5 mmol/L)，充分搖勻。再向1～6號(hào)試管中加入0.3 mL不同濃度的待測(cè)樣品溶液(或BHT溶液)。向7號(hào)試管中加入0.2 mL H2O2溶液(體積分?jǐn)?shù)1.8%)，8號(hào)試管中既不加樣品，也不加H2O2溶液，最后用去離子水定容。在37℃恒溫水浴中保溫反應(yīng)1 h，光譜掃描后，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)量吸光度。

式中 B1——加入待測(cè)樣品的羥基自由基體系的吸光值;

B2——不加H2O2體系的吸光值;

B3——加入H2O2體系的吸光值。

1.3.3 清除超氧自由基的能力測(cè)定［9］取7支試管，先依次加入5 mL Tris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液。在1～6號(hào)試管中，再依次加入0.3 mL不同濃度的待測(cè)樣品溶液(或BHT溶液)。7號(hào)試管中加入0.3 mL去離子水，作為空白對(duì)照，即鄰苯三酚自氧化率。在37℃恒溫條件下，水浴20 min，再加入0.3 mL 7.5 mmol/L鄰苯三酚溶液?？焖贀u勻，5 min內(nèi)，每30 s，在320 nm處測(cè)吸光度。最后，計(jì)算吸光度隨時(shí)間的變化率。

式中，C1和C2分別表示空白溶液和樣品溶液的吸光度隨時(shí)間的變化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 三白草乙醇提取物及溶劑萃取物的得率

三白草乙醇提取物及溶劑萃取物的得率見(jiàn)表1。

表1 三白草乙醇提物及溶劑萃取物的得率Table 1 Extraction rate of ethanol extract and various fractions of Saururus by extracting

2.2 清除DPPH自由基的能力

分別測(cè)定了三白草乙醇提取物經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同濃度的溶液對(duì)DPPH自由基的清除作用，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 三白草提取物各萃取部分對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on DPPH free radical

由圖1可知，三白草乙醇提物各萃取部分對(duì)DPPH自由基都具有一定的清除作用，并且隨著各萃取物濃度的增加，清除能力也逐漸增強(qiáng)。各萃取部分對(duì)DPPH自由基的清除能力為:乙酸乙酯層 ＞正丁醇層 ＞氯仿層 ＞石油醚層。其中乙酸乙酯萃取部分對(duì)DPPH自由基的清除能力相對(duì)最強(qiáng)，當(dāng)濃度在50 mg/L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為90.02%。

2.3 清除羥基自由基的能力

分別測(cè)定了三白草乙醇提取物經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同濃度的溶液對(duì)·OH自由基的清除作用，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 三白草提取物各萃取部分對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.2 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on·OH free radical

由圖2可知，三白草乙醇提物各萃取部分對(duì)·OH自由基都具有一定的清除作用，并且隨著各萃取物濃度的增加，清除能力也逐漸增強(qiáng)。各部分對(duì)·OH自由基的清除能力為:乙酸乙酯層 ＞正丁醇層 ＞石油醚層 ＞氯仿層。其中乙酸乙酯萃取部分對(duì)·OH自由基的清除能力相對(duì)最強(qiáng)，當(dāng)濃度在50 mg/L時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為45.12%。

2.4 清除超氧自由基的能力

分別測(cè)定了三白草乙醇提取物經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同濃度的溶液對(duì)超氧自由基的清除作用，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 三白草提取物各萃取部分對(duì)超氧自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on O2－·free radical

由圖3可知，三白草乙醇提物各萃取部分對(duì)超氧自由基都具有一定的清除作用，并且隨著各萃取物濃度的增加，清除能力也逐漸增強(qiáng)。各部分對(duì)超氧自由基的清除能力為:乙酸乙酯層＞正丁醇層＞氯仿層＞石油醚層。其中乙酸乙酯萃取部分對(duì)超氧自由基的清除能力相對(duì)最強(qiáng)，當(dāng)濃度在1.0 mg/L時(shí)，對(duì)超氧自由基的清除率為74.11%。

3 結(jié)論

(1)三白草乙醇提取物的各萃取部分都具有清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的能力，隨萃取物的濃度增加，清除能力增強(qiáng)。

(2)三白草乙醇提取物的各萃取部分對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的清除能力存在差異。可能是因?yàn)椴煌瑯O性的萃取溶劑對(duì)活性物質(zhì)的溶解度不同，所得到的活性物質(zhì)存在數(shù)量和種類(lèi)上的差異。

(3)三白草乙醇提取物乙酸乙酯萃取部分對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基的清除能力相對(duì)最強(qiáng)。三白草中含有黃酮類(lèi)物質(zhì)，而這類(lèi)物質(zhì)往往具有抗氧化性能?？赡苁且?yàn)橐宜嵋阴ト軇┡c該類(lèi)物質(zhì)的溶解度更為接近，因而萃取得到大部分的活性物質(zhì)。

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