肉桂酸生物法合成苯乙酮過程跟蹤的定量分析方法

孫松，馬麗，劉雄民，關文龍

(廣西大學化學化工學院，廣西南寧 530003)

苯乙酮廣泛應用于皂用香精和煙草香精等香料制造以及化妝品行業(yè)中。微生物合成苯乙酮則由于其生產過程環(huán)保，且具有良好的香氣品質而備受關注［1-2］。測定肉桂酸或苯乙酮方法主要有極譜法、薄層掃描法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、紫外分光光度法等［3-6］。其中紫外分光光度法由于其分析時間短、操作方法簡便而且分析成本低廉等優(yōu)點而最具應用和研究價值。但是發(fā)酵液自身的一些營養(yǎng)成分和菌體的紫外吸收有可能會干擾分析結果，目前主要通過額外配制加入底物前的發(fā)酵液作為參比溶液的方法扣除此類干擾［7］，該方法需要額外精確配制和儲備特殊參比溶液，并且對發(fā)酵液在加入底物前后的紫外吸收變化情況未做相應驗證。且發(fā)酵液自身的紫外吸收由于在加入底物后難以直接測定。因此，針對其在轉化過程中變化情況的相關研究也鮮有文獻報道。在由肉桂酸發(fā)酵制備苯乙酮的放大生產過程中，建立一種簡單快速的轉化率測定方法用于轉化過程的監(jiān)控，具有重要的實際應用意義。

本文利用投影模擬［8］的方法進行了肉桂酸苯乙酮相對含量的檢測，并將其做了延伸應用，首次利用該方法驗證了30 L發(fā)酵罐中菌株Mucor sp.發(fā)酵液自身紫外吸收在加入底物后的轉化過程中無明顯變化;并通過測定轉化初期肉桂酸含量的測量值與真實值(100%)之間的校正系數來扣除發(fā)酵液自身的干擾，將成分復雜的轉化液檢測簡化為簡單的肉桂酸和苯乙酮二組分檢測。該方法簡單有效，無需額外配制和儲備特殊參比溶液。且該方法的驗證和測量用轉化液樣品取自30 L中試用發(fā)酵罐，比傳統(tǒng)實驗中的搖瓶發(fā)酵更接近工業(yè)生產條件，因此，十分適用于微生物發(fā)酵工業(yè)生產中的條件優(yōu)化以及轉化率的快速檢測和過程跟蹤。另外，本文還將該方法與液相色譜法進行了比較。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

苯乙酮、肉桂酸、無水乙醇均為分析純;實驗菌種為本課題組篩選得到的菌種。

UV-2550型紫外-可見分光光度計;SPD-10A UV-VIS高效液相色譜儀(LC-20AT泵);色譜柱Alltima C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.2 溶液配制

1.2.1 肉桂酸和苯乙酮標準品溶液的制備 精確稱取相同摩爾濃度的肉桂酸和苯乙酮標準品(分別為0.261 8 g和0.212 2 g)，以無水乙醇溶解定容到100 mL的棕色容量瓶，分別配制成等摩爾濃度溶液Ⅰ和Ⅱ，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 轉化液的制備 將菌株 Mucor sp.接種于30 L發(fā)酵罐中，在適合的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。再加入90 g左右肉桂酸進行轉化，得到轉化液。

1.3 轉化液的液相色譜分析

準確移取轉化液2 mL，用無水乙醇稀釋定容至10 mL。離心，取上清液進行高效液相色譜分析。色譜條件:流動相為乙腈 ∶水 ∶冰醋酸=65∶35∶0.05;檢測波長 249 nm;流速 1.0 mL/min。

2 結果與討論

2.1 肉桂酸、苯乙酮及其混合物的紫外光譜特性

溶液Ⅰ和Ⅱ與肉桂酸相對摩爾含量0，20%，40%，60%，80%，100%的比例依次混合，得到6份總摩爾濃度相同的肉桂酸和苯乙酮混合溶液各10 mL。取20 μL再稀釋至10 mL后進行紫外掃描，結果見圖1。曲線1和曲線6分別為100%肉桂酸和100%苯乙酮的紫外吸收。

由圖1可知，肉桂酸和苯乙酮的最大吸收波長分別為272 nm和241 nm，曲線1～6交于O點，該點為兩化合物的等吸收點，波長為249 nm，當總摩爾濃度為3.53 ×10－5mol/L 時，吸光度為0.317 9。以標準溶液1～6在272 nm(此處吸光度差值最大，故選擇272 nm為檢測波長)的吸光度A272對肉桂酸相對摩爾含量X進行線性回歸，可得肉桂酸相對摩爾含量的回歸方程:

由于式(1)是在標準溶液等吸收點處的吸光度為0.317 9時得出，而待測樣品的吸收曲線①不滿足該方程的使用條件，因此需將樣品稀釋，得吸收曲線②，再利用等比例關系，模擬［8］出樣品在等吸收點處吸光度為0.317 9的吸收曲線③，吸收曲線③符合式(1)使用條件，此時利用式(1)即可求出肉桂酸相對摩爾含量。另由于發(fā)酵液自身存在紫外吸收，故式(1)不直接適用于轉化液中肉桂酸相對摩爾含量的測定，需扣除發(fā)酵液自身吸收干擾。

圖1 總摩爾濃度相同但相對摩爾含量不同的肉桂酸和苯乙酮混合物的紫外光譜Fig.1 UV spectrum of mixture of CMA and APO with the same molar fraction but different total molar concentration

2.2 轉化液定量分析方程的建立

2.2.1 發(fā)酵液自身紫外吸收變化驗證 于30 L發(fā)酵罐中分別移取適量轉化前(6 h)、中(72 h)、后期(96 h)轉化液，稀釋到適合濃度后測量其紫外吸收曲線，利用2.1節(jié)的方法模擬至同等吸收點后得到轉化前、中、后期吸收曲線1，2，3。再利用等比例關系，將曲線1，2投影模擬出曲線3'，見圖2。

圖2 由轉化前期曲線1與中期曲線2通過比例關系投影出的曲線3＇與后期實際吸收曲線3Fig.2 UV spectrum of fermentation broth in initial，middle and late stage(spectrum 1，2，3)and theoretical spectrum 3＇

由圖2可知，模擬出的吸收曲線3與實際吸收曲線3相吻合，表明發(fā)酵液的自身吸收在轉化的過程中無明顯變化，否則會由于受到發(fā)酵液自身吸收變化的影響，由前、中期投影模擬出的后期吸收曲線會與實際后期吸收曲線存在較大偏移。因此，該菌株發(fā)酵液自身紫外吸收在整個轉化過程中變化可忽略。

2.2.2 發(fā)酵液自身吸收干擾的扣除及總分析方程的建立 由于菌株Mucor sp.發(fā)酵液在轉化過程中其發(fā)酵液的背景吸收曲線無明顯變化，則可認為其在波長為272 nm處吸光度A0保持不變。式(1)可以變?yōu)?

其中，A0/0.697 5在整個轉化過程中不變，即為校正系數，在轉化初期(＜6 h)酶處于誘導時期時取樣，此時肉桂酸未轉化，含量為100%，校正系數可用下式求出:

聯(lián)立式(2)、(3)，得出轉化液定量分析方程:

其中，A總與 A總(初期)均為轉化液經稀釋模擬回歸至等吸收點為0.317 9時272 nm處的吸光度。

2.3 生物轉化液中肉桂酸和苯乙酮相對摩爾含量(轉化率)的測定

于轉化初期取樣，用無水乙醇稀釋至合適濃度后測量其249 nm與272 nm處吸光度A272(樣品)(初期)與 A249(樣品)(初期)，再通過稀釋，測得其稀釋液吸光度 A272(稀釋)(初期)和 A249(稀釋)(初期)，通過式(5)計算出 A總(初期)。

相同方法取樣，測試計算任意轉化時間吸光度A總，最后利用式(4)即可得出該轉化時刻肉桂酸相對摩爾含量X肉桂酸，苯乙酮相對摩爾含量(即轉化率)為100% －X肉桂酸。

2.4 精密度實驗

配制適宜質量濃度的肉桂酸和苯乙酮的標準品混合溶液25 mL，平行測定6次，結果見表1。

表1 方法的精密度Table 1 Precision of analysis method

由表1可知，兩者的重復性都較高，標準偏差(RSD)分別為 1.02%和 1.45%。

2.5 穩(wěn)定性實驗

配制適宜質量濃度的肉桂酸和苯乙酮的標準品混合溶液25 mL，室溫下放置，在24 h內測定溶液肉桂酸和苯乙酮的含量，結果見表2。

由表2可知，在24 h內兩者均比較穩(wěn)定，標準偏差(RSD)分別為4.94%和4.07%。

表2 方法的穩(wěn)定性Table 2 Stability of analysis method

2.6 回收率實驗

取3份相同已知濃度的樣品，分別添加低、中、高濃度的肉桂酸和苯乙酮標準品溶液，分別測定加標樣品中肉桂酸和苯乙酮的濃度(等吸收點測總濃度，式(1)測含量)，結果見表3。

由表3可知，肉桂酸和苯乙酮的平均回收率分別為101.34%和99.94%，標準偏差分別為1.53%和 0.46%。

表3 方法的回收率Table 3 Recovery of analysis method

2.7 生物轉化樣品的測定

將1份轉化液樣品稀釋到合適濃度后，使用上述UV法和HPLC分別測定3次，結果見表4。

表4 樣品的測定與t值檢驗Table 4 Determination of sample and t value test

經統(tǒng)計學的t檢驗，所得t值為1.92，小于結果的臨界值2.92(α=0.05)，表明這兩種方法無顯著性差異，說明所建立的分析方法準確可靠。

3 結論

針對微生物轉化液的紫外檢測時不可避免的發(fā)酵液自身的紫外吸收干擾問題，開展了生物轉化過程的復雜體系定量分析方法研究，得到了如下結論:

(1)投影模擬法證明發(fā)酵液在轉化期間其自身吸收無明顯變化后，通過初期取樣可獲得校正系數，可通過該校正系數扣除發(fā)酵液自身干擾。

(2)肉桂酸相對含量與吸光度關系為:X肉桂酸=100% － (A總(初)－ A總)/0.697 5，苯乙酮相對含量(即轉化率)與吸光度關系為:X苯乙酮=(A總(初)－A總)/0.697 5。A總與 A總(初期)均為轉化液經稀釋模擬回歸至等吸收點為0.317 9時272 nm處的吸光度。

(3)用t檢驗法將新建UV法與HPLC法進行判斷，兩種方法無顯著性差異。

(4)該方法的驗證與檢測所用轉化液樣品取自30 L中試用發(fā)酵罐，更接近工業(yè)生產條件。因此，該方法十分適用于微生物發(fā)酵工業(yè)生產中的條件優(yōu)化以及轉化率的快速檢測和過程跟蹤。

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