反相高效液相色譜法測定人尿中多種多環(huán)芳烴代謝物

楊紅梅，王永生，黎俊宏，歐陽運富

(1.江蘇省常州市中心血站，江蘇常州 213004;2.南華大學 公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽 421001;3.江蘇省常州市疾病預防控制中心，江蘇常州 213022)

多環(huán)芳烴是環(huán)境中典型的持久性有機污染物［1-2］。它們經(jīng)人體代謝后，可以生成多種不同的代謝物，通過對這些尿中代謝物的檢測可為人體對其接觸風險水平的綜合評價奠定基礎。目前同時檢測PAHs羥基代謝物的主要方法是色譜法［3-6］，但目前分析時間長達40 min左右。

研究利用反相高效液相色譜法建立同時檢測人尿樣中多種PAHs代謝物的新方法，其中主要包括1-羥基芘 (1-OHP)、α-萘酚 (α-NAP)、β-萘酚(β-NAP)、9-羥基菲(9-OHPe)、2-羥基芴(2-OHFlu)和9-羥基芴(9-OHFlu)。樣品經(jīng)過堿水解、富集及吹氮濃縮，采用高效液相檢測，外標法定量，縮短了樣品分析時間，在20 min內6種待測物質可完全分離。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1-羥基芘、α-萘酚、β-萘酚、9-羥基菲、2-羥基芴、9-羥基芴均為分析純;甲醇，色譜純;實驗用水為超純水(電阻18 MΩ)。

DionexP680高效液相色譜儀(配紫外檢測器);AB204-S電子分析天平;Aquapro純水機;UV-8500紫外/可見分光光度計;BF-2000氮氣吹干儀;PB-20(PB-S)酸度計。

1.2 試劑配制

1.2.1 1-OHP 標準儲備液(5.00 ×10－4mol/L)準確稱取 0.010 9 g 1-OHP，用 1∶1 甲醇-水(v∶v)溶解，并稀釋至100.0 mL。標準工作液由標準儲備液稀釋至5.00 ×10－6mol/L。

1.2.2 α-NAP 和 β-NAP 標準儲備溶液(5.00 ×10－3mol/L)準確稱取 0.072 g α-NAP 和 0.072 g β-NAP 分別用 1∶1 甲醇-水(v∶v)溶解，并相應稀釋至100.0 mL。標準工作液由標準儲備液稀釋至5.00 ×10－5mol/L。

1.2.3 9-OHPe標準儲備液(5.00 ×10－3mol/L)準確稱取 0.097 1 g 9-OHPe，用1∶1 甲醇-水(v∶v)溶解，并稀釋至100.0 mL，標準工作液由標準儲備液稀釋至5.00 ×10－5mol/L。

1.2.4 2-OHFlu 和 9-OHFlu 標準儲備液(1.00 ×10－3mol/L)分別準確稱取0.018 2 g 2-OHFlu和0.018 2 g 9-OHFlu，用1∶1 甲醇-水(v∶v)將其溶解并相應稀釋至100.0 mL，標準工作液由標準儲備液逐級稀釋至2.00 ×10－5mol/L。

1.3 色譜條件

色譜柱為 DiamonsilTMC18柱，5 μm，150 nm ×4.6 nm，等度洗脫，流速 0.95 mL/min，檢測波長280 nm，流動相為甲醇/乙酸鈉緩沖液，體積比為66∶34，相應的 pH=4.8，0.45 μm 濾膜過濾后當天使用，進樣量20 μL，溫度30℃。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

目前，PAHs液相色譜分析時大多數(shù)采用單一的254 nm作為分析PAHs組分的檢測波長，但大量研究表明254 nm只是PAHs組分共有的紫外吸收帶，對于某些組分并不是最佳吸收帶，具有一定的普適性，即在254 nm處吸光度并非達到最高。以甲醇-水(66∶34，v∶v)為參比溶液，分別對 α-NAP(5.00 μmol/L)、β-NAP(5.00 μmol/L)、1-OHP(0.50 μmol/L)、9-OHPe(5.00 μmol/L)、2-OHFlu(4.00 μmol/L)及 9-OHFlu(4.00 μmol/L)的甲醇-水溶液在200～350 nm波長進行紫外掃描，結果見圖1。

圖1 6種PAHs羥基代謝物標準溶液紫外吸收光譜圖Fig.1 The UV absorption spectrum of 6 kinds of PAHs metabolites standard solution

由圖1可知，6種PAHs代謝物在220～300 nm有較強的吸收，由于樣品中很多成分在220～240 nm范圍有吸收，但各自的特征吸收波長不同，為避免干擾，實驗選取280 nm作為測定波長。

2.2 流動相及流速的優(yōu)化

反復比較了色譜中甲醇-水、乙腈-水兩種常用流動相對待測物檢測的影響。結果表明，兩種流動相的靈敏度差不多，但考慮了乙腈毒性大及價格，故選擇甲醇-水。

實驗比較了流動相中甲醇體積含量對各待測物質保留時間及分離度的影響。結果表明，流動相中甲醇濃度＜55%時，1-OHP保留時間超過40 min;流動相中甲醇濃度＞75%時，待測物質的保留時間大大縮短，但同分異構體9-羥基芴、2-羥基芴及α、β-萘酚分離效果不好(r﹤1.0)。故實驗中甲醇與水體積比為 66∶34。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)待測物峰有點拖尾現(xiàn)象。為了控制待測物羥基電離，加入合適pH值的乙酸鈉-乙酸緩沖液，不僅能有較對稱的峰形，而且方法的靈敏度也得到提高。在pH 3.0～7.0，隨著酸度增加，待測物的保留時間縮短，而且峰形變窄。但流動相pH值＞5.5時各組分出峰時間延長;當pH值＜4.0時各組分出峰時間提前，但同分異構體分離效果不滿意，綜合實驗結果，選擇流動相pH值為4.8。流速對6種待測物分離的影響見圖2。

圖2 6種PAHs代謝物標準溶液色譜分離圖Fig.2 The chromatographic separation of 6 kinds of PAHs metabolites standard solution

由圖 2可知，流速為 0.95 mL/min時，6種PAHs代謝產(chǎn)物有良好分離。實驗條件為:流動相V(甲醇)∶V(乙酸鈉-乙酸緩沖液)=66∶34，流速0.95 mL/min，進樣量20 μL，紫外檢測器波長為280 nm。

2.3 柱溫的優(yōu)化

在20～40℃每5℃進行溫度實驗。實驗表明，保留時間與溫度呈反比，即溫度增加而保留時間縮短，但溫度＞30℃時，同分異構體分離效果不好。故實驗選擇柱溫為30℃。

2.4 標準曲線和檢出限

取不同體積的 1-羥基芘、α-萘酚、β-萘酚、9-羥基菲、2-羥基芴和9-羥基芴標準應用液，以甲醇∶乙酸鈉-乙酸緩沖液(66∶34)為溶劑，配制成不同濃度系列的標準混合溶液(在－5℃冰箱內至少可以穩(wěn)定15 d)，在優(yōu)化的色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標，以保留時間為橫坐標，得到各標準物質的定量標準曲線(見圖3)，表明各樣品在測定范圍內線性關系良好。按照S/N=2計算出各待測物的檢測限，結果見表1。

圖3 6種PAHs代謝物標準溶液色譜圖Fig.3 The chromatographic separation of 6 kinds of PAHs metabolites standard solution

表1 線性方程與相關系數(shù)Table 1 Linear equations and correlation coefficients

2.5 精密度和重復性實驗

選擇在線性范圍內高、低兩組濃度的混合標準液進行精密度實驗，取20 μL標準液連續(xù)進樣7次，結果見表2。

表2 峰面積和保留時間的相對偏差Table 2 Relative standard deviation of peak area and retention time

由表2可知，在優(yōu)化的色譜條件下同時測定α-萘酚、β-萘酚、2-羥基芴、9-羥基芴、9-羥基菲和 1-羥基芘具有很高的精確度和準確度。

2.6 共存物質的影響

實驗考察了檸檬酸、草酸、葡萄糖、尿素、萘胺、鳥嘌呤、苯酚、對硝基苯酚和間硝基苯酚等共存物質對 1-羥基芘、α-萘酚、β-萘酚、9-羥基菲、2-羥基芴和9-羥基芴測定的影響。結果表明，這些物質對測定均無影響，由此可見該法選擇性好。

2.7 樣品測定

收集了開水房鍋爐工和學齡前兒童尿樣各1份，在－4℃冰箱冷藏過夜。參照文獻［6-9］的方法，采用堿水解法處理尿樣。取濃縮液20 μL注入HPLC分析，在上述條件下測定樣品中的9-羥基菲、α-萘酚、β-萘酚、1-羥基芘、2-羥基芴和 9-羥基芴含量，測定6次，取其均值。結果及見表3和圖4。

表3 樣品測定結果Table 3 Determination results of samples

圖4 小孩尿樣(a)、鍋爐工尿樣(b)和尿樣加標(c)的色譜圖Fig.4 The chromatographic of the child urine sample(a)the boiler fireman sample(b)and added the boiler fireman sample(c)

2.8 尿樣加標回收實驗

在已知樣品濃度中，分別加入低高兩組濃度的9-羥基菲、α-萘酚、β-萘酚、1-羥基芘、2-羥基芴和 9-羥基芴標準混合液，在優(yōu)化的實驗條件下測定并計算出它們的加標回收率，結果見表4。

表4 回收率測定結果(n=6)Table 4 Determination results of recovery

續(xù)表

由表 4 可知，9-羥基菲、α-萘酚、β-萘酚、1-羥基芘、2-羥基芴和 9-羥基芴的平均回收率分別為91.0%，100.4%，101.0%，92.6%，106.7% 和95.5%。

3 結論

建立了用反相高效液相色譜同時測定尿中6種代謝產(chǎn)物的新方法。該方法線性范圍寬，準確性好，靈敏度高，用于尿樣測定，結果與文獻報道相符。適用大批量的樣本測定，為PAHs暴露的流行病學調查提供了快速方法。

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