參麥注射液對大鼠心臟細(xì)胞色素P450酶的調(diào)節(jié)作用

張紅曦，王宇光，馬增春，梁乾德，肖成榮，譚洪玲，湯響林，董 志，高 月

參麥注射液源自《癥因脈治》中的參麥飲，是由等量的人參和麥冬提純后混合制成的中藥注射液，臨床用于治療心力衰竭、冠狀動脈粥樣硬化、病毒性心肌炎、肺心病、粒細(xì)胞減少等癥。其中，參麥注射液在心臟方面的臨床應(yīng)用較為廣泛，尤其在西藥常規(guī)治療的基礎(chǔ)上顯示了一定的療效。近年來花生四烯酸細(xì)胞色素P450代謝酶與心血管疾病的相關(guān)性已有大量報道，提示花生四烯酸的CYP450環(huán)氧化物酶代謝物EETs具有心血管保護(hù)作用［1－4］；而花生四烯酸經(jīng)細(xì)胞色素 P450（CYP450）羥化酶 ω-羥化后，生成的20-羥二十烷四烯酸（20-HETE）在心肌細(xì)胞肥大時濃度明顯的升高，即CYP羥化酶抑制劑對心臟起到保護(hù)作用［4－5］。本文從花生四烯酸細(xì)胞色素P450代謝酶方向，應(yīng)用qPCR的方法探討了參麥注射液對其的調(diào)節(jié)作用，從心臟CYP系統(tǒng)探討參麥注射液對心臟的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 實驗動物 實驗用SD大鼠（SPF級），♂，32只，體質(zhì)量（200±10）g，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物（飼料）許可證號：SCXK-（軍）2007-004；分籠飼養(yǎng)，每籠 4只，保持溫度22℃～24℃，濕度60%～65%，自由進(jìn)食飲水，實驗動物實驗設(shè)施許可證號：SYXK-（軍）2007－004。

1.2 主要藥品與試劑 參麥注射液（生藥含量：紅參0.1 g·ml－1，麥冬0.1 g·ml－1）、紅參注射液（生藥含量：紅參0.1 g·ml－1）和麥冬注射液（生藥含量：麥冬0.1 g·ml－1）均由正大青春寶藥業(yè)提供，其中參麥注射液批號：1107201。RNA提取試劑盒為Biomed公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒為TransGen公司產(chǎn)品，SYBR Green SuperMix為Applied Biosystems公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備 電子天平（德國Sartorious BS223S），超低溫冰箱（Sanyo MDF-U53V），高速低溫離心機(jī)（Heraeus Labofuge 400R），水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表公司 HW·SYII-K），PCR儀［Gene-Amp PCR System 2400（PE Applied Biosystem）］；ABI StepOne／StepOnePlus實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.4 動物分組及給藥方法 SD大鼠32只隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為空白對照組（Control）、參麥注射液組（SMI）、紅參注射液組（HSI）和麥冬注射液組（MDI），以上各組動物均采取腹腔注射的方式分別給予參麥注射液（10 ml·kg－1·d－1）、紅參注射液（10 ml·kg－1·d－1）、麥冬注射液（10 ml·kg－1·d－1）、空白對照組給予等量生理鹽水，連續(xù)14 d，于d 15制取肝微粒體。

2 方法

2.1 大鼠心臟組織總RNA的提取 大鼠處死后迅速取出心臟，置于液氮中保存。按Biomed公司RNA提取試劑盒說明書提取心臟總RNA，取心臟組織50～100 mg，加1 ml裂解液勻漿混勻，在15～30℃條件下孵育5 min，加氯仿200μl，劇烈震蕩15 s后室溫孵育 3 min，4℃，12 000 r·min－1離心 10 min，將上層水相移入新管中，加入1倍體積的70%乙醇，顛倒混勻。全部轉(zhuǎn)入吸附柱RA中，12 000 r·min－1離心45 s后棄掉廢液，加入500μl去蛋白液，12 000 r·min－1離心 45 s后棄掉廢液，加入 500 μl漂洗液，12 000 r·min－1離心 45 s后棄掉廢液，再次漂洗后13 000 r·min－1離心2 min，取出吸附柱RA，放入一個rNase free離心管中，在吸附膜中間部位加入50～80μl Rnase free water，室溫放置2 min，12 000 r·min－1離心1 min。用紫外分光光度計測定 A260／A280比值，用以檢測 RNA的純度，A260／A280比值大于1.7～1.9，可用于下一步的實驗。

2.2 實時熒光定量PCR 按TransGen公司一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實驗。取總RNA 1 μg，加入 2×TS Reaction Mix 10μl，TS RT／RI Enzyme Mix 1μl，Anchored Oligo（dT）1μl，加 RNasefree H2O至終體積為20μl并混勻。逆轉(zhuǎn)錄的條件為：42℃30 min，85℃5 min。產(chǎn)物在 －20℃ 保存?zhèn)溆?。按ABI公司SYBR Green SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行qPCR實驗。取轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，2×Fast SYBR Green Master Mix 10μl，特異性引物正義鏈和反義鏈各0.5μl，加RNase-free H2O至終體積為20μl并混勻，反應(yīng)條件：起始變性95℃20 s，循環(huán)時95℃3 s，60℃30 s進(jìn)行40個循環(huán)，最后熔解曲線95℃15 s，60℃1 min。特異性引物序列見Tab 1

3 結(jié)果

利用qPCR檢測3個不同的處理組，擴(kuò)增多種CYP同工酶統(tǒng)計結(jié)果見Tab 2。

3.1 參麥注射液及其單藥對CYP1家族mRNA表達(dá)的影響 從結(jié)果看（Fig 1），與空白組相比較參麥注射液組對CYP1A1、CYP1B1 mRNA表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

Tab 1 Primer sequence of rat P450 isoenzymes in qPCR reaction analysis

Tab 2 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of CYP isozymes by qPCR

3.2 參麥注射液及其單藥對CYP2家族mRNA表達(dá)的影響 從結(jié)果看（Fig 2），與空白組相比較參麥注射液組對CYP2C11、CYP2E1和CYP2J3 mRNA表達(dá)均有明顯的上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），紅參注射液組對CYP2B1、CYP2E1 mRNA表達(dá)有明顯的上調(diào)作用，麥冬注射液組對CYP2B1和CYP2C11 mRNA表達(dá)有明顯的下調(diào)（P＜0.01）。

3.3 參麥注射液及其單藥對CYP4家族mRNA表達(dá)的影響 從結(jié)果看（Fig 3），除 CYP4A3、CYP4F6外，與空白組相比較參麥注射液組對CYP4家族mRNA表達(dá)均有明顯的上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），紅參注射液組對 CYP4A3和 CYP4F1 mRNA表達(dá)有明顯的上調(diào)作用（P＜0.01），麥冬注射液組對CYP4 F1和CYP4F6 mRNA表達(dá)有明顯的上調(diào)（P＜0.01）。

3.4 參麥注射液及其單藥對ANP、BNP mRNA表達(dá)的影響 從結(jié)果看（Fig 4），與空白組相比較參麥注射液組對ANP、BNPmRNA表達(dá)有明顯的上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），麥冬注射液組對ANP和BNP mRNA表達(dá)有明顯的上調(diào)（P＜0.01），紅參注射液組對ANP和BNP mRNA表達(dá)與空白組比較未發(fā)生改變。

Fig 1 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of CYP 1 subfamily in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

3.5 參麥注射液及其單藥對 EPHX2mRNA表達(dá)的影響 從結(jié)果看（Fig 5），與空白組相比較參麥注射液組、紅參注射液和麥冬注射液對EPHX2mRNA表達(dá)均有上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

4 討論

參麥注射液已成為中醫(yī)臨床常用注射劑，在心血管疾病、糖尿病、血液疾病等多種臨床疾病中廣泛應(yīng)用。趙敏等［6］證實，參麥注射液對大鼠局灶性腦缺血損傷有一定的保護(hù)作用；同時［7］研究顯示，參麥注射液有對抗大鼠心肌缺血／再灌注性心律失常作用；參麥注射液在改善急性心肌梗死大鼠心功能、左室重構(gòu)作用方面也具有明顯作用［8］。本文以心臟P450酶為考察指標(biāo)，探索參麥注射液對心臟細(xì)胞色素P450酶mRNA表達(dá)的影響，為深入研究參麥注射液心臟保護(hù)作用新的可能途徑提供線索。

Fig 3 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of CYP 4 subfamily in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

Fig 4 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of ANP and BNP in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）是人體最重要的代謝酶，參與生物體內(nèi)源性物質(zhì)（如類固醇激素、花生四烯酸等）和外源性物質(zhì)（如藥物、環(huán)境致癌物等）的生物轉(zhuǎn)化［9］?；ㄉ南┧幔ˋA）通過CYP途徑可產(chǎn)生兩類二十烷酸：經(jīng)CYP表氧化酶代謝產(chǎn)生表氧－二十碳三烯（epoxyeicosatrienoicacid，EETs），包括 5，6-、8，9-、11，12-、14，15-EET 4種異構(gòu)體；經(jīng)CYPω-羥化酶代謝為羥－二十烷 四 烯 酸 （ hydroxyeicosatetraenoicacid，HETEs）。EETs作為內(nèi)皮衍生的超級化因子主要成分，其具有的擴(kuò)張血管、抗血栓纖溶和促缺血組織血管形成等作用，已證實在治療心腦缺血性疾病中有明顯療效。而HETE具有的縮血管則有加重疾病的可能。因此本文選擇與心血管疾病密切相關(guān)的CYP亞型，探討參麥注射液對上述亞型的影響，有助于發(fā)現(xiàn)參麥注射液新的作用靶點和探析參麥方的配伍規(guī)律。

Fig 5 Effects of SMI，HSI and MDI on mRNA expression of EPHX2 in rat hearts（ˉx±s，n＝8）

本實驗主要考察參麥注射液對細(xì)胞色素P450酶各亞家族中重要亞型mRNA表達(dá)的影響。其中CYP1、4家族是代謝花生四烯酸生成HETEs的主要合成羥化酶，而HETEs具有縮血管作用，與心血管疾病發(fā)病密切相關(guān)。目前尚未見參麥注射液對CYP1、4家族影響的報道，但是有報道指明AA經(jīng)CYP4ω-羥化酶代謝所產(chǎn)生的20-HETE會擴(kuò)大缺血／再灌注損傷［11］。本實驗結(jié)果顯示參麥注射液對CYP1、4家族中除CYP4A3和CYP4F6，其他各亞型具有不同程度的誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致花生四烯酸代謝產(chǎn)生的HETE有增加的趨勢，進(jìn)而可能加重心臟損傷。而對于CYP450中最為重要的CYP2家族，有報道顯示：CYP2J產(chǎn)生的EETs的心臟保護(hù)功能的機(jī)制與線粒體KATP通道有關(guān)，CYP2C9抑制劑具有心臟保護(hù)作用［12］。蘆玲巧等［13］研究發(fā)現(xiàn)心肌轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒CYP2J3組能夠減少缺血期及再灌注期心肌梗死面積。CYP2J3作為最重要的環(huán)氧化物酶，參與代謝花生四烯酸生成EETs，EETs對心肌細(xì)胞功能有重要的影響。有研究表明，5，6-EET和11，12-EET能明顯增加大鼠心肌收縮力。在離體缺血／再灌注大鼠心臟模型，11，12-EET能明顯恢復(fù)缺血／再灌注后的心肌收縮力［14－15］。EETs可以上調(diào) eNOS，產(chǎn)生血管舒張效應(yīng)，在心臟保護(hù)方面有明顯作用［16］。本實驗結(jié)果顯示參麥注射液對CYP2J3有明顯的誘導(dǎo)趨勢，進(jìn)而能增加花生四烯酸代謝成EETs，產(chǎn)生心臟的保護(hù)作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)心房利鈉肽（ANP）和腦利鈉肽（BNP）在心臟負(fù)荷過重或心臟擴(kuò)大時分泌增加［17］，可反映心臟的功能狀態(tài)。ANP和BNP同屬利鈉肽家族，都具有利鈉、利尿、舒張血管作用，在心功能不全時可拮抗交感神經(jīng)、抗利尿激素和腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)等神經(jīng)內(nèi)分泌因素的過度激活，從而起到維護(hù)心功能的作用［18］。本實驗顯示，參麥注射液對ANP、BNP均呈明顯誘導(dǎo)作用，其水平的上調(diào)有助于增強(qiáng)心臟的功能。

可溶性環(huán)氧化酶水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）是EETs代謝的主要酶類之一，可將EETs代謝為生物活性明顯減弱的二羥基-20碳三烯酸（dihydroxyicosatrienoic acids，DHET）。本實驗結(jié)果顯示參麥注射液對sEH基因（EPHX2）有明顯上調(diào)的作用，可能造成EETs轉(zhuǎn)化，心臟保護(hù)活性減弱。

綜合實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅參注射液對CYP2B1具有誘導(dǎo)的作用，但麥冬注射液對其表現(xiàn)出的明顯的抑制作用，參麥注射液對CYP2B1的作用雖然沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但具有誘導(dǎo)的趨勢，提示紅參注射液對CYP2B1的誘導(dǎo)作用可能強(qiáng)于麥冬注射液的抑制作用。參麥注射液對CYP2E1、CYP4F1和EHPX2的誘導(dǎo)，同時顯示紅參注射液與麥冬注射液均對CYP2E1、CYP4F1和EHPX2具有誘導(dǎo)作用，提示參麥注射液對其的誘導(dǎo)作用可能由復(fù)方中的紅參和麥冬共同貢獻(xiàn)。參麥注射液對ANP和BNP均具有誘導(dǎo)的作用，同時麥冬注射液也顯示出明顯的誘導(dǎo)，提示在對ANP和BNP的作用中麥冬比紅參的作用更強(qiáng)。

綜上，參麥注射液對CYP450酶的影響與心血管的保護(hù)作用是對各亞酶調(diào)節(jié)的綜合反映，參麥注射液對CYP2J3作用明顯，在細(xì)胞水平上也具有明顯的量效關(guān)系［19］，而對其他亞型作用，特別是CYP4家族的誘導(dǎo)作用弱于CYP2J3，因此CYP2J3產(chǎn)生的心臟保護(hù)作用明顯強(qiáng)于CYP4家族可能帶來的心臟損傷。由于CYP2J3、ANP和BNP等相關(guān)分子是心血管的重要靶點，而參麥注射液對心血管疾病療效明確，因此心臟P450酶系統(tǒng)可能是參麥注射液治療心血管疾病新的可能途徑或靶點，其對 CYP2J3、ANP和BNP誘導(dǎo)作用的分子機(jī)制及其與心血管疾病的發(fā)生關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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