堿性成纖維細(xì)胞生長因子注射方式及劑量對(duì)大鼠外周神經(jīng)損傷修復(fù)的影響*

劉煥興，季日旭，麻光喜，沈新升，蔡仲卿，王蘋

(浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 1.骨科；2.神經(jīng)內(nèi)科，溫州 325001)

·藥物研究·

堿性成纖維細(xì)胞生長因子注射方式及劑量對(duì)大鼠外周神經(jīng)損傷修復(fù)的影響*

劉煥興1，季日旭1，麻光喜1，沈新升1，蔡仲卿1，王蘋2

(浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 1.骨科；2.神經(jīng)內(nèi)科，溫州 325001)

目的 探討堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)靶肌內(nèi)注射方式及劑量對(duì)大鼠外周神經(jīng)損傷修復(fù)的影響。方法坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型大鼠45只,行神經(jīng)顯微縫合手術(shù)后分為A、B、C、D、E組,每組9只。A、B、C組手術(shù)后靶肌內(nèi)單部位分別注射bFGF 800,400,200 U,D組多部位注射bFGF 200 U,E組(對(duì)照組)注射等量0.9%氯化鈉注射液。手術(shù)后8周肌電圖檢查運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、肌肉動(dòng)作電位幅值和肌纖顫電位波幅。結(jié)果各靶肌內(nèi)注射bFGF組與對(duì)照組比較運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌肉動(dòng)作電位波幅增加,纖顫電位波幅降低(均P<0.05)。多部位注射bFGF(D組)相比單部位注射bFGF組(C組)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌肉動(dòng)作電位波幅增加,纖顫電位波幅降低(P<0.05)。不同劑量單部位注射bFGF組間的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌肉動(dòng)作電位波幅以及纖顫電位波幅差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論靶肌內(nèi)注射bFGF能促進(jìn)大鼠神經(jīng)再生,注射方式和有效劑量對(duì)神經(jīng)修復(fù)有影響。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子；損傷,神經(jīng)；注射方式；藥物劑量

周圍神經(jīng)完全損傷后,手術(shù)縫合對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)往往有限。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子。神經(jīng)損傷后,bFGFmDNA及其蛋白的表達(dá)顯著上調(diào),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量快速增加,都能有效促進(jìn)外周坐骨神經(jīng)的損傷修復(fù)［1］。研究證實(shí),周圍神經(jīng)損傷后,外源性bFGF是通過逆行軸漿運(yùn)輸方式到達(dá)神經(jīng)節(jié)而對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用的［2］。又基于神經(jīng)一般發(fā)出多條分支支配肌肉的現(xiàn)實(shí),筆者嘗試評(píng)估靶肌內(nèi)注射bFGF的不同劑量和不同方式對(duì)治療周圍神經(jīng)損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選擇清潔級(jí)成年SD大鼠(醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字2203001)45只,體質(zhì)量200～250 g,雌雄不限,由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(浙)2010-0150］提供。動(dòng)物模型制備:大鼠經(jīng)0.3%戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)腹腔麻醉,備皮,消毒后在無菌條件下進(jìn)行手術(shù)。右下肢背側(cè)部縱向切口,暴露股二頭肌,經(jīng)肌間鈍性分離,游離坐骨神經(jīng),距梨狀肌下緣1 cm處切斷坐骨神經(jīng),用8-0顯微縫線在顯微鏡下行神經(jīng)外膜縫合。

1.2 模型制備 bFGF(珠海東大生物制藥有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字S10980077,劑型:溶液,規(guī)格:每瓶63 000 U)的活性成分為重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子,4 000 U·mL-1。常規(guī)顯微器械。Keypoint肌電誘發(fā)電位儀(丹麥)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 制備以上45只大鼠坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型［3］,行神經(jīng)顯微縫合手術(shù)后分為5組,每組9只。A組為手術(shù)后靶肌內(nèi)單部位注射bFGF 800 U,B組為單部位注射bFGF 400 U,C組為單部位注射bFGF 200 U,D組為多部位注射bFGF 200 U,E組為對(duì)照組,注射等量0.9%氯化鈉注射液。手術(shù)后動(dòng)物每周靶肌內(nèi)注射2次,連續(xù)注射4周。

1.4 電生理測定坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度 各組動(dòng)物手術(shù)后8周麻醉,解剖出縫合后的大鼠坐骨神經(jīng),剪斷沿途分支,記錄電極采用針形電極,于距小腿(踝)關(guān)節(jié)上方1 cm處插入腓腸肌,用針插入大鼠尾部接地。兩個(gè)刺激電極分別在神經(jīng)的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端測量神經(jīng)傳導(dǎo)速度,肌肉動(dòng)作電位幅值。測量肌纖顫電位波幅時(shí),針電極探入失神經(jīng)肌肉,確定最大峰-峰波幅區(qū)域,移動(dòng)針電極使波幅最大,記錄最大纖顫電位波幅。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用單因素方差分析比較單部位注射不同濃度bFGF組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度,肌肉動(dòng)作電位波幅以及肌纖顫電位波幅,采用成組t檢驗(yàn)比較不同方式組(C組和D組)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、肌肉動(dòng)作電位波幅以及肌纖顫電位波幅。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組(A、B、C、D組)和對(duì)照組(E組)間的差異 手術(shù)后8周,各不同bFGF劑量和不同方式注射組相比注射0.9%氯化鈉注射液組,其神經(jīng)傳導(dǎo)速度(圖1)和肌肉動(dòng)作電位幅值均增加(圖2)(P<0.05)；最大纖顫電位波幅均減小(圖3)(P<0.05)。此外,大體觀察肌肉萎縮情況,對(duì)照組較各bFGF組肌肉萎縮更明顯。

2.2 不同劑量組間(A、B、C組)的差異 經(jīng)單因素方差分析,手術(shù)后8周,不同bFGF劑量注射組在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(圖1)、肌肉動(dòng)作電位波幅(圖2)和肌纖顫電位波幅(圖3)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 5組大鼠手術(shù)后8周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較與E組比較,*1P<0.05;與D組比較,t=2.9,*2P<0.05Fig.1 Com parison of motor nerve conduction velocity am ong five groups of rats eight weeks after operationCompared with group E,*1P<0.05;compared with group D, t=2.9,*2P<0.05

圖2 5組大鼠手術(shù)后8周肌肉動(dòng)作電位波幅比較與E組比較,*1P<0.05;與D組比較,t=3.8,*2P<0.05Fig.2 Com parison of m uscle action potential am p litude among five groups of rats eight weeks after operationCompared with group E,*1P<0.05;compared with group D, t=3.8,*2P<0.05

圖3 5組大鼠手術(shù)后8周肌纖顫電位波幅比較與E組比較,*1P<0.05Fig.3 Comparison of muscle fibrillation potential am p litude among five groups of rats eight weeks after operationCompared with group E,*1P<0.05

2.3 不同注射方式組間(C、D組)的差異 經(jīng)成組t檢驗(yàn),手術(shù)后8周,不同bFGF方式注射組間在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(圖1)和肌肉動(dòng)作電位波幅(圖2)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A、B、C、D組肌纖顫電位波幅(圖3)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但與E組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

bFGF具有生物活性［4］,能保護(hù)受傷神經(jīng)元,促進(jìn)軸突再生,促進(jìn)許旺細(xì)胞分裂增殖,但成纖維細(xì)胞生長因子的應(yīng)用受自身生物學(xué)特性和外界環(huán)境的影響相當(dāng)大,在神經(jīng)損傷周圍應(yīng)用時(shí)蛋白的穩(wěn)定性和生物活性不容易保持。研究證實(shí),周圍神經(jīng)損傷后,外源性bFGF是通過逆行軸漿運(yùn)輸方式到達(dá)神經(jīng)節(jié)而對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用的［2］。GROTHE等應(yīng)用125I-bFGF對(duì)bFGF在舌下神經(jīng)內(nèi)的運(yùn)輸方式進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)125I-bFGF能沿舌下神經(jīng)纖維逆向運(yùn)輸至舌下神經(jīng)核。這種bFGF在體內(nèi)逆向攝取的方式為體內(nèi)bFGF參與修復(fù)神經(jīng)損傷提供了一種可能。研究證實(shí)靶向肌內(nèi)注射有助于外周神經(jīng)損傷的修復(fù)［5-6］。

有效補(bǔ)充外源性bFGF能提高神經(jīng)修復(fù)的能力,但是不同濃度bFGF對(duì)神經(jīng)修復(fù)作用的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)靶肌內(nèi)攝取bFGF的量用于逆向傳導(dǎo)修復(fù)神經(jīng)是有限的。高劑量bFGF相比低劑量bFGF在修復(fù)神經(jīng)的效果相似。筆者推斷靶肌肉逆向攝取外來bFGF的有效量往往小于200 U。這也要求以后研究外來因子靶向肌肉攝取逆向修復(fù)神經(jīng)損傷時(shí)劑量不在多。

神經(jīng)進(jìn)入肌肉往往都是發(fā)出一系列的分支,之后再發(fā)出分支支配各個(gè)部分的肌肉。單部位注射外來因子使得游離的因子局限化,不能彌散到肌肉的各個(gè)部位,也不能為各個(gè)神經(jīng)細(xì)分支所攝取。筆者嘗試多部位注射bFGF,以達(dá)到神經(jīng)損傷部位有效的神經(jīng)修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)多部位相比單部位同劑量的bFGF注射神經(jīng)修復(fù)效果更加明顯。因此推斷單根神經(jīng)末梢吸收外來營養(yǎng)有限,往往需要多部位多根神經(jīng)共同完成營養(yǎng)的吸收,以達(dá)到理想的神經(jīng)修復(fù)效果。

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌肉動(dòng)作電位波幅是評(píng)價(jià)神經(jīng)功能的重要指標(biāo)。神經(jīng)損傷后,神經(jīng)功能喪失,神經(jīng)顯微修復(fù)后,神經(jīng)功能獲得了重建的可能,借助bFGF,傳遞至神經(jīng)損傷部位,能保護(hù)神經(jīng)元,促進(jìn)神經(jīng)再生,提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。同時(shí),神經(jīng)損傷后容易發(fā)生肌內(nèi)失神經(jīng),繼而出現(xiàn)肌肉萎縮。肌電圖纖顫電位衡量失神經(jīng)肌肉萎縮較為常用,肌細(xì)胞的纖顫電位為失神經(jīng)肌細(xì)胞的特征性改變,研究顯示纖顫電位波幅與肌萎縮狀態(tài)相一致,可作為評(píng)估肌肉萎縮程度的定量指標(biāo)［7］。本研究顯示神經(jīng)損傷手術(shù)后采用bFGF靶肌內(nèi)注射治療后仍存在肌肉萎縮現(xiàn)象,多部位有效量注射bFGF有助于神經(jīng)再支配肌肉,預(yù)防肌肉萎縮。

本研究結(jié)合神經(jīng)發(fā)出分支支配肌肉的解剖學(xué)特點(diǎn),同時(shí)注重藥物濃度,揭示了多部位有效量的注射bFGF,更適合于神經(jīng)損傷的修復(fù)和延緩肌肉的萎縮。但本研究尚不能對(duì)外源性因子bFGF逆向修復(fù)神經(jīng)進(jìn)行定量,仍需進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.002

Effect of In jection Site and Doseage of Basic Fibroblast Growth Factor on Rats Peripheral Nerve Regeneration

LIU Huan-xing,JI Ri-xu,MA Guang-xi,SHEN Xin-sheng,CAI Zhong-qing,WANG Ping
(1.Department of Osteopaedics;2.Department of Neurology,Traditional Chinese Medicine Hospital of Wenzhou Ctiy,Wenzhou 325001,China)

Objective To explore the effectof administrationmethod and dosageof basic fibroblastgrowth factor(bFGF) on rats peripheral nerve regeneration.MethodsA total of 45 rats were injured by sciatic nerve cut and sutured.Nerve microscopic suturewas applied to repair nerve before rats were divided into five groups.After operation,groups A,B,C were injected with 800,400,and 200 U of bFGF solution in themuscle,respectively.For group D,200 U was injected inmultiple sites. For group E,equivalent salinewas injected.Motor nerve conduction velocity,muscle evoked action potential and fibrillation potential amplitudewere evaluated by electromyography 8 weeks after the operation.ResultsCompared with the control group,themotor nerve conduction velocity and muscle evoked action potential were significantly higher in the groups of bFGF and the fibrillation potential amplitude was lower in bFGF groups(P<0.05).Themultiple-site bFGF injection showed remarkably highermotor nerve conduction velocity,muscle evoked action potential and lower fibrillation potential amplitude(P<0.05).No significant difference was showen between groups of different doses of bFGF in motor nerve conduction velocity,muscle evoked action potential and fibrillation potential amplitude(P>0.05).ConclusionThe bFGF injected at targeted sites in muscle can promote nerve regeneration in rats.Themethod of administration and the dosemay influence the nerve regeneration.

Basic fibroblast growth factor;Injury,nerve;Route of adm inistration;Doseage of drug

R971;R965

A

1004-0781(2014)01-0005-03

2013-03-12

2013-07-23

*溫州市科技局基金資助項(xiàng)目(Y2006A048)

劉煥興(1970-),男,浙江溫州人,主治醫(yī)師,學(xué)士,主要從事醫(yī)院骨科臨床工作。電話：0577-88057025,E-mail：wzlhx@139.com。