反復(fù)植入失敗—胚胎因素的重要性

李博，王曉紅

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710065）

盡管我們?cè)谳o助生殖領(lǐng)域已經(jīng)取得了非常大的成就，但仍然有許多患者承受著反復(fù)種植失敗帶來的巨大的心理壓力和高昂的治療費(fèi)用。目前，國際上對(duì)反復(fù)種植失?。≧ecurrent Implantation Failure，RIF）仍然沒有一個(gè)統(tǒng)一的定義，通常將經(jīng)歷2～6次體外受精（IVF）周期或者移植10個(gè)高質(zhì)量胚胎仍未獲妊娠，視為RIF［1］。而且在具體的IVF臨床工作中，3次IVF周期未獲妊娠的患者即應(yīng)引起高度重視［2］。

胚胎植入宮腔的過程依賴于很多因素的同步化，如胚胎質(zhì)量、理想的培養(yǎng)條件、子宮內(nèi)膜容受性和母體免疫系統(tǒng)等。植入過程中胚胎與內(nèi)膜的關(guān)系，被很多學(xué)者形象的比喻為“種子”和“土地”之間的關(guān)系。Patrizio等［3］明確提出，RIF的發(fā)生主要由種子（胚胎因素）決定。另外，早在1886年就有宮外孕的報(bào)道［4］，而且在1942年英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上報(bào)道了一篇關(guān)于一位腹腔妊娠后產(chǎn)出活嬰的病例［5］，從而從另一個(gè)視角揭示了胚胎在植入過程中的重要作用。

因此，本綜述將從胚胎視角審視其在RIF中扮演的重要角色，并從染色體異常、透明帶硬化、體外培養(yǎng)條件、滋養(yǎng)層細(xì)胞功能以及胚胎早期代謝等方面，進(jìn)行深度的解析和討論。

一、染色體異常

染色體異常主要包括染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常。目前公認(rèn)，在發(fā)生RIF的患者中，高比例的染色體異常是主要原因之一。下面，我們將從父、母雙方染色體和胚胎染色體兩個(gè)方面進(jìn)行闡述。

Raziel等［6］以65位重度RIF患者（≥6次IVF周期或者≥15個(gè)移植胚胎數(shù)）外周血為材料進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示，染色體結(jié)構(gòu)異常如異位、倒位、微缺失等的比例顯著增高。另有研究也支持此觀點(diǎn)，Stern等［7］觀察到RIF患者中染色體異常的比例為2．5%，且主要表現(xiàn)為異位（相互、羅氏）高發(fā)。因此，他們建議針對(duì)這些RIF患者，最好在IVF之前進(jìn)行相應(yīng)的遺傳咨詢。近年來，有學(xué)者專注于精子染色體異常與RIF之間的相關(guān)性研究。Rubio等［8］報(bào)道在少弱畸精癥患者夫婦中，植入率和臨床妊娠率均顯著降低，該學(xué)者利用三色熒光原位雜交（FISH）技術(shù)針對(duì)13、18、21、X和 Y染色體進(jìn)行了非整倍性和二體性比例的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，RIF患者進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）治療后，性染色體二體性的比例顯著增高。另有研究證明，精子DNA損傷程度越高，其胚胎植入率和妊娠率越低［9］。而且進(jìn)一步的研究顯示，精子DNA損傷程度的增加與IVF或者ICSI后流產(chǎn)率增加密切相關(guān)［10］。因此，大量證據(jù)表明，不論來自父源或者母源的染色體異常因素，在RIF致病機(jī)理中均扮演著重要的角色。

我們知道，染色體非整倍性可以降低胚胎成功植入和妊娠的機(jī)率，但遺憾的是，現(xiàn)行的胚胎形態(tài)分級(jí)方法無法排除掉非整倍性胚胎，為RIF患者挑選出更具植入潛能的胚胎。有國外學(xué)者對(duì)高齡、反復(fù)流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗的患者進(jìn)行了胚胎的植入前染色體篩查（Preimplantation Genetic Screening，PGS），數(shù)據(jù)顯示，這些患者在IVF周期內(nèi)獲得的卵母細(xì)胞或者胚胎具有高比例的非整倍性，并分析認(rèn)為，胚胎的非整倍性是植入失敗的主要原因［3］。通過FISH技術(shù)對(duì)RIF患者第3天卵裂球的染色體（13、16、18、21、22以及 X和 Y）進(jìn)行檢測，Pehlivan等［11］報(bào)道，在發(fā)生3次及3次以上IVF失敗的患者胚胎中，非整倍性比例高達(dá)67%。另有一項(xiàng)研究選擇了20名RIF的患者，仍然是活檢了單個(gè)卵裂球，但使用了比較基因組雜交技術(shù)（CGH），結(jié)果顯示，胚胎非整倍性達(dá)到了60%［12］，這與前者的研究相一致。該項(xiàng)研究中檢測的染色體異常，包括一兩條染色體非整倍性和復(fù)雜的染色體異常，因此，研究者認(rèn)為，在人類早期胚胎中，不論是母源細(xì)胞質(zhì)因子還是細(xì)胞周期控制因子突變?cè)斐傻娜旧w復(fù)制和分離障礙，均是引起RIF的主要原因。

二、透明帶硬化

哺乳動(dòng)物的卵子周圍被一層透明帶包被著，透明帶主要由糖蛋白、碳水化合物以及透明帶特異蛋白組成［13］。透明帶在精子結(jié)合、誘導(dǎo)頂體反應(yīng)以及精卵結(jié)合方面發(fā)揮著重要作用［14］。在自然狀況下，精卵結(jié)合后會(huì)發(fā)生透明帶硬化，這是一種生理性變化，主要起到阻止多精受精、保護(hù)植入前胚胎完整性和有利于輸卵管運(yùn)輸?shù)淖饔茫?5］。在早期卵裂時(shí)期，透明帶的存在可以維持內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的完整性，但是在囊胚擴(kuò)張時(shí)期，必須先發(fā)生孵化，才能完成植入［16］。在生殖領(lǐng)域，出于生殖力保存或者因?yàn)槟承┰驘o法進(jìn)行新鮮周期移植的原因，我們通常會(huì)通過冷凍技術(shù)，將卵母細(xì)胞和胚胎進(jìn)行冷凍。有學(xué)者認(rèn)為，冷凍后卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒會(huì)提前釋放，造成透明帶硬化，從而影響精子穿透卵母細(xì)胞的能力［17］。1992年，Wood等［18］研究發(fā)現(xiàn)，冷凍－解凍后透明帶發(fā)生硬化會(huì)明顯阻礙受精過程，尤其影響體外受精時(shí)精子的穿透。導(dǎo)致受精失敗的機(jī)制可能是透明帶硬化會(huì)消耗精子的能量，降低精子穿透，并且改變精子頭部的結(jié)合位點(diǎn)。Tian等［19］研究發(fā)現(xiàn)，冷凍劑處理和開放式拉長塑料細(xì)管法冷凍綿羊卵母細(xì)胞，透明帶消化時(shí)間明顯比對(duì)照組長。冷凍劑毒性試驗(yàn)組和玻璃化冷凍組單精子入卵率顯著低于對(duì)照組。由于冷凍劑毒性試驗(yàn)組和玻璃化冷凍組透明帶消化時(shí)間和單精子入卵率相比差異不顯著，故認(rèn)為，只有將卵母細(xì)胞暴露于冷凍劑中才會(huì)引起透明帶硬化和導(dǎo)致精子穿透率降低。囊胚期擴(kuò)張后透明帶的裂解失敗，會(huì)造成孵化受損和RIF發(fā)生［15］。有研究顯示，凍融過程會(huì)導(dǎo)致透明帶增厚和彈性下降，影響胚胎的孵化，而通過對(duì)解凍后胚胎的激光輔助孵化，可以顯著提高植入率和臨床妊娠率［20］。

三、體外培養(yǎng)條件

使用高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)液無疑是IVF成功的基礎(chǔ)。不完善的胚胎培養(yǎng)體系會(huì)損害胚胎發(fā)育潛能［21］，進(jìn)而導(dǎo)致RIF發(fā)生。因此，我們需要通過滲透壓檢測、pH測定和精子生化實(shí)驗(yàn)等保證培養(yǎng)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化。而且，在某些RIF患者中，也許我們有必要采用一些個(gè)性化的培養(yǎng)方案來優(yōu)化胚胎發(fā)育。

在IVF臨床，大約有3%的患者會(huì)因?yàn)榕咛ベ|(zhì)量太差而發(fā)生無可用胚胎移植或者植入失敗。Sermondade等［22］選擇了一些IVF反復(fù)受精失敗的患者，這些患者的獲卵數(shù)和受精率都是正常的，但當(dāng)胚胎發(fā)育到第2天的時(shí)候便發(fā)生了高比例（60%）的碎片化（≥40%）。因此，研究者們改變了移植策略，在原核期便進(jìn)行了移植，結(jié)果獲得了單胚6．4%的臨床妊娠率和18．9%的活產(chǎn)率。并且進(jìn)一步得出結(jié)論，不合適的體外培養(yǎng)條件會(huì)大大影響本來質(zhì)量就不好的胚胎發(fā)育，從而導(dǎo)致胚胎植入失敗。

四、滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞

在胚胎發(fā)育成桑椹胚后，桑椹胚進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞開始出現(xiàn)分化。聚集在胚胎的一端，個(gè)體較大的細(xì)胞，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM），而沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列的，個(gè)體較小的細(xì)胞，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞（Trophectoderm，TE），它們?cè)谂咛ブ踩脒^程中發(fā)揮著重要的作用，將來會(huì)發(fā)育成胎膜和胎盤。

在植入發(fā)生之前，哺乳動(dòng)物的胚胎必須脫離透明帶的包被，才能與子宮內(nèi)膜發(fā)生實(shí)質(zhì)性的接觸。關(guān)于透明帶裂解的機(jī)制目前不是十分清楚。很多的研究都停留在描述性研究的層面，通過體外觀察，描述如下：透明帶的裂解始于囊胚擴(kuò)張，不斷的擴(kuò)張使得透明帶變得越來越薄，直至發(fā)生裂解，使得囊胚從透明帶的包裹中排出，樣子看起來就像一個(gè)啞鈴，這個(gè)過程稱為孵化。但是這樣的孵化模型受到了越來越多的質(zhì)疑［23］，并且對(duì)胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測意義不大［24］。TE細(xì)胞質(zhì)突觸在透明帶裂解以及植入中的作用，引起了人們的關(guān)注。關(guān)于TE細(xì)胞質(zhì)突觸的研究不多，最早的要追溯到1883年，Spee等［25］在豚鼠中第一次描述了TE細(xì)胞質(zhì)突觸可以穿透透明帶，多年后Blandau等［26］驗(yàn)證了他們的研究結(jié)果。1990年，有學(xué)者通過小鼠胚胎TE細(xì)胞質(zhì)突觸的體外觀察，發(fā)現(xiàn)植入前囊胚、植入延遲的囊胚與發(fā)生植入的囊胚相比，TE細(xì)胞質(zhì)突觸的有無和形態(tài)區(qū)別很大，并認(rèn)為其在囊胚植入過程中起著重要的作用［27］。Gonzales等［28］利用先進(jìn)的Time-lapse技術(shù)對(duì)馬、牛和人類胚胎進(jìn)行了實(shí)時(shí)觀察，結(jié)果顯示，在囊胚期，這三類胚胎的TE細(xì)胞確實(shí)會(huì)長出細(xì)胞質(zhì)突觸，進(jìn)而通過生長和一定角度的運(yùn)動(dòng)穿透透明帶（圖1），并且證明隨后發(fā)生的胚胎孵化過程，正是位于這個(gè)穿透點(diǎn)［24］（圖2），TE細(xì)胞質(zhì)突觸主要起到穿透和在子宮內(nèi)膜上錨定的作用。2010年Stoikos等［29］研究顯示，高濃度的activin A分子可以抑制TE細(xì)胞中具有粘附能力的分子的表達(dá)，從而導(dǎo)致植入失敗。近年來，許多研究顯示，TE細(xì)胞的質(zhì)量對(duì)胚胎植入和活產(chǎn)率有很好的預(yù)測作用。由此可見，TE細(xì)胞確實(shí)在胚胎植入過程中發(fā)揮著重要的作用。

圖1 TE細(xì)胞質(zhì)突觸通過一系列角度運(yùn)動(dòng)穿透透明帶［24］

圖2 胚胎孵化發(fā)生在TE細(xì)胞質(zhì)突觸穿透點(diǎn)［24］

五、胚胎發(fā)育潛能預(yù)測

從前面的論述中，我們可以看到，現(xiàn)行的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)體系，還不足以精準(zhǔn)地篩選出發(fā)育潛能好的胚胎，那么，除了我們前面提到的PGS和植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）的方法外，還有什么指標(biāo)可以預(yù)測胚胎的發(fā)育和植入潛能呢？

人類白細(xì)胞抗原G（HLA-G）屬非經(jīng)典 HLA－I類抗原，最早在人類胎盤組織中發(fā)現(xiàn)［30］，主要在母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)［27］，是母體對(duì)同種半異體抗原的胎兒免疫應(yīng)答中重要的免疫耐受分子。有研究表明，可溶性 HLA-G（sHLA-G）存在于體外培養(yǎng)幾天后的胚胎培養(yǎng)液中，由胚胎分泌，并且與胚胎的植入潛能密切相關(guān)［31］。Yao等［32］研究了HLA-G分子在植入前胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在2細(xì)胞卵裂期開始，便有不同亞型的HLA-G分子開始表達(dá)，當(dāng)胚胎發(fā)育至囊胚期時(shí)，HLA-G便開始特異性表達(dá)于滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，開始為植入做準(zhǔn)備。王曉紅等［33］也證明了在卵裂早期便有HLA-G分子的表達(dá)，與上述結(jié)論一致。巨瑛等［34］收集了41名患者的84份胚胎培養(yǎng)液，通過ELISA方法測定了sHLA-G的濃度，sHLA-G陽性率為52%（44／84），陽性培養(yǎng)液中sHLA-G 濃度為3．7～16．6ng／ml。移植至少一個(gè)sHLA-G陽性胚胎的妊娠率為69%，移植胚胎全部為sHLA-G陰性者的妊娠率為18%，差異顯著（P＜0．05）。另外，F(xiàn)ishel等［35］通過腹腔鏡手術(shù)獲取卵母細(xì)胞，并進(jìn)行了體外受精和培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在胚胎卵裂早期，無法檢測到β-HCG，當(dāng)胚胎發(fā)生致密化時(shí)，便可以檢測到β-HCG含量，囊胚時(shí)期達(dá)到43U／L，孵化后達(dá)到6，033U／L，差異極顯著（P＜0．01）。大量研究顯示，β-HCG 與胚胎植入密切相關(guān)［36－38］。

胚胎植入失敗還與子宮內(nèi)膜容受性以及胚胎與子宮之間的對(duì)話有關(guān)，但正如我們上面的論述一樣，胚胎質(zhì)量在其中起到了非常重要的作用，而且這種重要性甚至遠(yuǎn)超我們的理解和想象。

［1］ Tan BK，Vandekerckhove P，Kennedy R，et al．Investigation and current management of recurrent IVF treatment failure in the UK［J］．BJOG，2005，112：773-780．

［2］ Margalioth EJ，Ben-Chetrit A，Gal M，et al．Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET［J］．Hum Reprod，2006，21：3036-3043．

［3］ Patrizio P，Bianchi V，Lalioti MD，et al．High rate of biological loss in assisted reproduction：it is in the seed，not in the soil［J／OL］．Reprod Biomed Online，2007，14：92-95．

［4］ Robertson GJ．A case of extra-uterine Pregnancy：death of the f?tus at four months：intestinal obstruction from pressure：removal of the f?tus by perineal section：recovery［J］．Br Med J，1886，1（1311）：288-289．

［5］ Gushue-Taylor G．Full-term extra-uterine pregnancy with living child［J］．Br Med J，1942，1（4246）：640．

［6］ Raziel A，F(xiàn)riedler S，Schachter M，et al．Increased frequency of female partner chromosomal abnormalities in patients with high-order implantation failure after in vitro fertilization［J］．Fertil Steril，2002，78：515-519．

［7］ Stern C， Pertile M， Norris H，et al．Chromosome translocations in couples with in-vitro fertilization implantation failure［J］．Hum Reprod，1999，14：2097-2101．

［8］ Rubio C，Gil-Salom M，Simón C，et al．Incidence of sperm chromosomal abnormalities in a risk population：relationship with sperm quality and ICSI outcome［J］．Hum Reprod，2001，16：2084-2092．

［9］ Bungum M，Humaidan P，Axmon A，et al．Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome［J］．Hum Reprod，2007，22：174-179．

［10］ Zini A，Boman JM，Belzile E，et al．Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI：systematic review and meta-analysis［J］．Hum Reprod，2008，23：2663-2668．

［11］ Pehlivan T，Rubio C，Rodrigo L，et al．Impact of preimplantation genetic diagnosis on IVF outcome in implantation failure patients［J／OL］．Reprod Biomed Online，2003，6：232-237．

［12］ Voullaire L，Wilton L，McBain J，et al．Chromosome abnormalities identified by comparative genomic hybridization in embryos from women with repeated implantation failure［J］．Mol Hum Reprod，2002，8：1035-1041．

［13］ Bleil JD，Wassarman PM．Structure and function of the zona pellucida：identification and characterization of the proteins of the mouse oocyte’s zona pellucida［J］．Dev Biol，1980，76：185-202．

［14］ van Duin M，Polman JE，De Breet IT，et al．Recombinant human zona pellucida protein ZP3produced by chinese hamster ovary cells induces the human sperm acrosome reaction and promotes sperm-egg fusion［J］．Biol Reprod，1994，51：607-617．

［15］ De Vos A，Van Steirteghem A．Zona hardening，zona drilling and assisted hatching：new achievements in assisted reproduction［J］．Cells Tissues Organs，2000，166：220-227．

［16］ Trounson AO，Moore NW．The survival and development of sheep eggs following complete or partial removal of the zona pellucida［J］．J Reprod Fertil，1974，41：97-105．

［17］ Wood MJ，Barros C，Candy CJ，et a1．High rates of survival and fertilization of mouse and hamster oocytes after vitrification in dimethyl sulfoxide［J］．Biol Reprod，1993，49：489-495．

［18］ Wood MJ，Whittingham DG，Lee SH，et a1．Fertilization failure of frozen mouse oocytes is not due to premature cortical granule release［J］．Biol Reprod，1992，46：1187-1195．

［19］ Tian SJ，Yan CL，Yang HX，et a1．Vitrification solution containing DMSO and EG can induce parthenogenetic activation of in vitro mature ovine ooeytes and decrease sperm penetration［J］．Anim Reprod Sci，2007，101：365-372．

［20］ Basak B，Bulent U，Kayhan Y，et al．Laser-assisted hatching increases pregnancy and implantation rates in cryopreserved embryos that were allowed to cleave in vitro after thawing：a prospective randomized study［J］．Hum Reprod，2006，21：2136-2140．

［21］ Gardner DK，Reed L，Linck D，et al．Quality control in human in vitro fertilization［J］．Semin Reprod Med，2005，23：319-324．

［22］ Sermondade N，Delarouzière V，Ravel C，et al．Characterization of a recurrent poor-quality embryo morphology phenotype and zygote transfer as a rescue strategy［J／OL］．Reprod Biomed Online，2012，24：403-409．

［23］ Gonzales DS，Bavister BD．Zona pellucida escape by hamster blastocysts in vitro is delayed and morphologically different compared with zona escape in vivo［J］．Biol Reprod，1995，52：470-480．

［24］ Bavister BD．Culture of preimplantation embryos，facts and artifacts［J］．Hum Reprod Update，1995，1：91-148．

［25］ Spee GF．Beitrag zur entwickelungsgeschichte der fruheren stadien des meerschweinchens bis zur vollendung der keunblase［J］．Archiv Anat Physiol［Ger］，1883，7：44-60．

［26］ Blandau RJ．Observations on implantation of the guinea pig ovum［J］．Anas Rec，1949，103：19-47．

［27］ McRae AC， Church RB．Cytoplasmic projections of trophectoderm distinguish implanting from preimplanting and implantation-delayed mouse blastocysts［J］．J Reprod Fertil，1990，88：31-40．

［28］ Gonzales DS，Jones JM，Pinyopummintr T，et al．Implantation：Trophectoderm projections：apotential means for locomotion，attachment and implantation of bovine，equine and human blastocysts［J］．Hum Reprod，1996，11：2739-2745．

［29］ Stoikos CJ，Salamonsen LS，Hannan NJ，et al．Activin A regulates trophoblast cell adhesive properties：implications for implantation failure in women with endometriosis associated infertility［J］．Hum Reprod，2010，25：1767-1774．

［30］ Ellis SA，Sargent IL，Redman CW，et al．Evidence for a novel HLA antigen found on human extravillous trophoblast and a choriocarcinoma cell line［J］．Immunology，1986，59：595-601．

［31］ Kovats S，Main EK，Librach C，et al．A class I antigen，HLAG，expressed in human trophoblasts［J］．Science，1990，248：220-223．

［32］ Yao YQ，Barlow David H，Sargent IL．Differential expression of alternatively spliced transcripts of HLA-G in human preimplantation embryos and inner cell masses ［J］．Immunology，2005，175：8379-8385．

［33］ 王曉紅，姚元慶，羅亞寧 ．HLA-G蛋白在人類著床前胚胎的表達(dá)［J］．生殖與避孕，2006，26：271-274．

［34］ 巨瑛，王曉紅，羅亞寧，等 ．胚胎分泌的可溶性人類白細(xì)胞抗原G（sHLA-G）與IVF臨床妊娠率的相關(guān)性研究［J］．生殖與避孕，2009，29：257-260．

［35］ Fishel SB，Edwards RG，Evans CJ．Human chorionic gonadotropin secreted by preimplantation embryos cultured in vitro［J］．Science，1984，223：816-818．

［36］ Ertzeid G，Tanbo T，Dale PO，et al．Human chorionic gonadotropin levels in successful implantations after assisted reproduction techniques［J］．Gynecol Endocrinol，2000，14：258-263．

［37］ Kato K，Sairam MR，Manjunath P．Inhibition of implantation and termination of pregnancy in the rat by a human chorionic gonadotropin antagonist［J］．Endocrinology，1983，113：195-199．

［38］ Palomino WA，Argando?a F，Azúa R，et al．Complement C3 and decay-accelerating factor expression levels are modulated by human chorionic gonadotropin in endometrial compartments during the implantation window［J］．Reprod Sci，2013，20：1103-1110．