微波消解-分子熒光猝滅法測(cè)定蜂膠中痕量硒*

張修景

(菏澤學(xué)院化學(xué)與化工系，山東菏澤，274015)

硒(Se)作為一種人體必需微量元素，具有重要的生理功能及廣泛的藥理作用，硒的缺乏與過剩都與人的生命休戚相關(guān)［1－2］。人體內(nèi)共含有硒14～21 mg，成年人需 50 μg/d，兒童需 15 ～25 μg/d［3］。蜂膠能有效提高人體的免疫功能、促進(jìn)細(xì)胞的再生作用、富含硒等多種微量元素，是較理想的補(bǔ)硒食品。

目前，硒的測(cè)定方法有多種。其中較為成熟的方法包括分子熒光法［4］、原子吸收光譜法、原子熒光法［5］、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、分光光度法、氣相色譜法［6］、高效液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法等［7］。作者采用微波消解作為樣品前處理方法，具有消解快速、溶劑用量少、硒流失少、節(jié)省能源、對(duì)環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于傳統(tǒng)消解手段;通過對(duì)已有分子熒光測(cè)定硒含量的方法進(jìn)行改進(jìn)，用熒光猝滅法代替直接熒光測(cè)定法靈敏度高，選擇性好;用HCl將消化液中的Se(Ⅵ)全部還原成Se(Ⅳ)，再與碘化物和羅丹明B發(fā)生顯色反應(yīng);當(dāng)I3－與羅丹明B形成離子締合物時(shí)，羅丹明B溶液的熒光明顯猝滅，在一定的條件下熒光猝滅值與硒(IV)的濃度成正比;從而測(cè)定蜂膠樣品中痕量的硒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

F－280熒光分光光度計(jì)，天津港東科技發(fā)展股份有限公司;WX－4000微波快速消解系統(tǒng)，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司;電子天平，上海分析儀器廠生產(chǎn)型號(hào):EST180－4;DHT型攪拌調(diào)溫電熱套;比色皿等。

HNO3、HCl(優(yōu)級(jí)純);1%硝酸溶液;0.01 mol/L HCl溶液;羅丹明B(分析純)，0.007%羅丹明B水溶液;KI(分析純)，5%碘化鉀溶液;硒粉(分析純);實(shí)驗(yàn)用水均為三重蒸餾水;蜂膠(菏澤產(chǎn)品)。

1.2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置與儲(chǔ)存

10 μg/mL Se標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液:準(zhǔn)確稱取 Se粉0.001 0 g，加入100 mL燒杯中，然后加入5.00 mL濃HNO3和3.00 mL濃HCl中，將溶液用水浴蒸發(fā)至盡干，加水溶解殘?jiān)⒂?00mL容量瓶中用水定容，貯存于4℃的冰箱中備用，用時(shí)逐級(jí)稀釋為1.0 μg/mL Se標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液:分別吸取1.0 μg/mL的Se溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 加入 50 mL容量瓶，再分別加入0.01 mol/L的 HCl 1.00 mL、0.007%羅丹明B溶液2.00mL、5%KI1.00 mL，用水稀釋至刻度并搖勻，得到含硒0.00、0.020 0、0.040 0、0.060 0、0.080 0、0.100 μg/mL 的 Se 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 熒光分光光度計(jì)的工作條件

F－280熒光分光光度計(jì)的工作條件見表1。

表1 儀器工作條件Table 1 Working conditions of instrument

1.3.2 微波消解的工作條件(表2)

表2 WX－4000微波消解工作條件Table 2 The conditions of WX－4000 microwave digestion

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取含 Se 0.00、0.020 0、0.040 0、0.060 0、0.080 0、0.100 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在適宜的條件下與KI溶液和羅丹明B反應(yīng)，按1.3.1儀器工作條件測(cè)量熒光強(qiáng)度分別為:3 446.03、3 366.22、3 296.30、3 226.43、3 156.74、3 086.28;ΔF 分別為:0、79.81、149.73、219.60、289.29、359.76;并用 ΔF(F0－F)對(duì)硒的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～0.100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，Se(IV)的濃度與ΔF成正比。其線性回歸方程是y=3 536.1x+4.76，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

1.5 蜂膠樣品的預(yù)處理及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取 0.426 7、0.392 0、0.416 1、0.423 1 g 樣品于清潔干燥的消化罐中，加入5 mL濃HNO3，3.00 mL濃HCl，采用溫度控制，按1.3.2工作條件消解，消解完畢，冷卻降壓后，將消解罐取出，轉(zhuǎn)入100毫升燒杯中，加入3.00 mL濃HCl，將溶液用水浴蒸發(fā)至盡干，加少量水將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，再加入0.01 mol/L的HCl 1.00 mL，用水稀釋至20 mL左右，加入羅丹明B溶液2.00 mL，搖勻。再加KI溶液1.00 mL，用水稀釋至刻度并搖勻，待用。

將上述待測(cè)的4種樣品分別在1.3.1儀器工作條件下，選擇發(fā)射波長(zhǎng)為577 nm處測(cè)得離子締合物熒光強(qiáng)度 F 分別為 3 423.16、3 425.56、3 425.02、3 424.81;ΔF(F0－ F)分別為 22.87、20.47、21.01、21.22;分別帶入線性方程y=3 536.1x+4.76，求出硒的含量分別為 0.0051 21、0.004 44、0.004 595、0.004 654 μg/mL;考慮試樣體積和蜂膠的稱樣量可計(jì)算出蜂膠樣品中平均含硒0.569 2 mg/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)射光譜

圖1中曲線1、2分別表示試劑空白(碘化物與羅丹明B溶液)和Se(IV)－I－－RhB溶液發(fā)射光譜，從450～750 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描得最大發(fā)射波長(zhǎng)在577 nm處，由于離子締合物的形成使試劑空白的熒光強(qiáng)度發(fā)生了顯著猝滅。

圖1 試劑空白溶液與硒標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)射光譜圖Fig.1 Emission spectrum image of reagent blank solution and selenium standard slotion

2.2 試劑濃度的影響和檢出限

碘化鉀溶液(5%)加入0.50～1.50 mL為宜，即它的適宜濃度是3×10－4～6×10－4mol/L，本實(shí)驗(yàn)選1.0 mL。羅丹明B溶液(0.007%)的適宜加入量是1.0～4.0 mL，最佳濃度是2×10－6～2×10－5mol/L，本試驗(yàn)選2.0 mL。

將試樣空白平行測(cè)定11次，計(jì)算所得數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，取3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢出限。測(cè)得本法的最低檢出濃度為0.001 0 μg/mL。

2.3 溶液溫度的影響

取含硒0.080 0 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，在適宜的條件下與碘化鉀溶液和羅丹明B反應(yīng)，分別控制溶液溫度5、10、15、20、25、30、35、40℃按 1.3.1 儀器工作條件測(cè)量熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)在室溫(10～25℃)下，熒光猝滅值變化很小，但隨著溫度的進(jìn)一步提高，熒光猝滅值顯著降低。故選擇室溫反應(yīng)。

2.4 熒光猝滅反應(yīng)機(jī)理討論

室溫條件下，向pH=3.00的羅丹明B和碘化鉀二元體系溶液中加入不同量的Se4+標(biāo)準(zhǔn)溶液，首先生成，然后羅丹明B(熒光型體)與I3－反應(yīng)形成了無熒光的離子締合物。由于此反應(yīng)能構(gòu)成吸收光譜的改變，而且熒光猝滅又伴隨著溫度的升高而降低，因此它是一個(gè)靜態(tài)猝滅反應(yīng)［8］。

雖然I－也能引起羅丹明B的熒光猝滅，但它的猝滅能力比I3－低得多。I－和對(duì)于羅丹明B的熒光半猝滅濃度分別為5×10－4mol/L和3×10－9mol/L，即的熒光猝滅能力比I－高105倍以上。由于Se(IV)與I－的氧化-還原反應(yīng)具有倍增效應(yīng)，而且對(duì)羅丹明B又有很強(qiáng)的熒光猝滅能力，故用碘化物-羅丹明B體系熒光猝滅法測(cè)定硒(IV)靈敏度高。

2.5 精密度和回收率試驗(yàn)

向待測(cè)樣品中分別加入不同量的硒，采用與樣品相同的前處理和熒光光度計(jì)測(cè)定條件做回收率試驗(yàn)，用加標(biāo)后測(cè)定值減去原試樣測(cè)定值再除以加標(biāo)量來計(jì)算加標(biāo)回收率，每種加標(biāo)量測(cè)定4次，并計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以確定精密度，加標(biāo)回收率見表3，精密度見表4。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The experimental results of standard addition recoveries

由表3知，在蜂膠樣品中分別加入不同標(biāo)量的硒，得回收率在96.8% ～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)均＜4.2%。說明此法重現(xiàn)性良好，準(zhǔn)確度較高，試樣前處理過程中硒的損失量較少，可以滿足痕量硒的分析要求。

表4 蜂膠樣品精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=4)Table 4 The precision test of propdis samples(n=4)

2.6 干擾及消除

在本實(shí)驗(yàn)中，有多種常見離子干擾硒的測(cè)定，如Fe3+、Cu3+、Co3+等離子會(huì)影響實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)加入少量的EDTA溶液可掩蔽干擾離子，因此可有效地消除干擾［9－10］。

3 結(jié)論

聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織規(guī)定含硒超過0.10 mg/kg的食品為富硒食品。按照本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)蜂膠中痕量硒進(jìn)行測(cè)定，通過線性標(biāo)準(zhǔn)曲線可求之蜂膠中痕量硒的含量0.569 2 mg/kg。由此可表明，蜂膠應(yīng)視為富硒營(yíng)養(yǎng)品。本人采用微波消解-分子熒光猝滅法測(cè)定蜂膠中痕量硒，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.2%，硒元素的加標(biāo)回收率在96.8% ～103%，硒元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 5，線性關(guān)系好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，測(cè)定方法簡(jiǎn)便，可推廣使用。

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