分子印跡聚合物在高效液相色譜柱中的應用

唐萍萍，李 華

（廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006）

分子印跡聚合物在高效液相色譜柱中的應用

唐萍萍，李 華

（廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006）

綜述了分子印跡聚合物的制備原理、制備方法，介紹了分子印跡聚合物作為高效液相色譜固定相在分子印跡整體色譜柱、分子印跡填充色譜柱中的應用現(xiàn)狀及 存在的問題。

分子印跡聚合物；高相液相；分子印跡整體柱；分子印跡填充柱

分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers, MIPs）是以某種物質(zhì)為模板分子，模板分子與單體上的某些功能基團通過共價鍵或非共價鍵的作用形成復合物，加入交聯(lián)劑，發(fā)生聚合后，將 模板分子從聚合物中去除，形成在功能基排列和空間結構上都與模板相匹配的空穴的高聚物[1]。20世紀40年代諾貝爾獲得者Pauling[2]提出抗體的形成學說，1972年Wulff G研究小組首次合成分子印跡聚合物，直至Mosbach等人發(fā)表關于以茶堿為模板聚合物的報道，MIPs才得到廣泛的研究和應用。隨著分子印跡技術逐漸成熟，分子印跡聚合物已經(jīng)被廣泛研究和開發(fā)。MIPs由于高選擇性和穩(wěn)定的物理性能成為當前高選擇材料之一，在色譜分離[3-5]、傳感器[6-7]、膜分離[8]、模擬酶催化[9]和藥物控制釋放[10]等領域得到應用。MIPs作為高效液相色譜柱的固定相， 將分子印跡的高選擇性和高效液相的高靈敏度、分析 范圍寬、分析速率快的優(yōu)點相結合，并已經(jīng)應用于拆分手性物質(zhì)[11]、藥物的檢測[12]、植物成分的提取分離、蛋白質(zhì)的分離與檢測[13]等方面。本文就分子印跡聚合物制備及其在HPLC色譜柱上的應用現(xiàn)狀進行介紹。

1 分子印跡聚合物的制備

1.1 分子印跡聚合物的制備原理

分子印跡聚合物制備主要有3個步驟：1）模板分子與具有適當功能基的功能單體形成復合物；2）加入交聯(lián)劑與功能單體互相交聯(lián)聚合形成聚合物，在三維空間上將功能單體的功能基固定下來；3）通過一定的化學手段將模板分子去除，即可得到具有“記憶”三維孔穴的聚合物，此聚合物能與模板分子再次結合，并對模板分子具有特異性識別，如“鎖-鑰匙”的關系。根據(jù)模板分子與功能單體之間相互作用性質(zhì)不同，分子印跡可分為預組裝法、自組裝法及犧牲空間法，其制備MIPs原理示意圖見圖1，其優(yōu)缺點見表1。

圖1 MIPs制備原理示意圖

1.2 分子印跡聚合物的制備方法

分子印跡聚合物得到了廣泛的研究和應用，根據(jù)不同應用領域的要求，對分子印跡聚合物的制備方法進行了不斷的改進。迄今為止，制備分子印跡聚合物主要有以下幾種。

1）本體聚合法。本體聚合法屬于包埋法，是傳統(tǒng)的制備MIPs的方法。它是將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑等溶解于惰性溶劑中，將其轉入玻璃瓶進行交聯(lián)聚合，得到塊狀的聚合物。此方法制備條件容易控制，操作簡單，實驗干擾因素較少；但是聚合物通常為塊狀，要經(jīng)過粉碎、研磨、過篩等繁瑣的后處理。研磨過程中，聚合物會存在一些不規(guī)則的顆粒，同時也會破壞結合位點，且制備時印跡位的包埋，模板分子較難除去，導致分子印跡聚合物的飽和吸附量小，利用率低。由于本體聚合存在這些明顯的問題，所以該方法已經(jīng)逐漸被其他方法代替。

表1 預組裝法、自組裝法及犧牲空間法的對比

2）原位聚合法（In Site Polymerization），是指在空的色譜柱或毛細管柱內(nèi)直接合成MIPs作為固定相的方法，此方法主要用于合成MIP-HPLC整體柱。其優(yōu)點為操作簡單、產(chǎn)率高、實用性強，減少本體聚合后處理的繁瑣過程。但是該方法制備的MIPHPLC柱有柱壓高、選擇性差、色譜峰拖尾嚴重等問題，限制了其在現(xiàn)實分離中的應用，但可以通過改變致孔劑的比例，采用梯度洗脫等方法避免上述的一些問題。

3）懸浮聚合法，是將溶有模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑等的有機相加入到水相中，形成油相小液滴懸浮在水相中聚合，是最常用、簡便制備聚合物球形的方法之一，懸浮聚合物球形顆粒粒徑一般為0.01～5mm。懸浮聚合法制備MIPs通常用水作為分散相，水極性較大，會影響模板與功能單體之間氫鍵的形成，因此Mayes, A. G.等[18]，Ansell, T. J.[19]采用全氟烴作為分散相制備MIPs，并用此聚合物作為高效液相色譜柱固定相，發(fā)現(xiàn)色譜柱柱壓低，傳質(zhì)速度慢，全氟烴分散效果較好，但是價格昂貴。陸續(xù)有研究者用液體石蠟、硅油等物質(zhì)作為分散相合成分子印跡聚合物，但是都存在一些問題[20-21]。目前，最常用的分散相為水，雖然影響氫鍵形成，但是環(huán)保、成本低、分散性好，也能更好地適應工業(yè)生產(chǎn)。該方法制備的MIPs在高效液相色譜、固相萃取等方面得到應用。

4）沉淀聚合，也稱為非均相溶液聚合法，將反應物（模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等）溶解于分散劑中，反應始于均相體系，隨著聚合反應的進行，反應物進行聚合，聚合達到一定程度時，聚合物以沉淀的形式從溶液中析出。沉淀聚合法制備MIPs可能是塊狀、凝膠狀、球形顆粒等，沉淀聚合物顆?？尚≈良{米[22]。此方法操作簡單、產(chǎn)率高，若想得到均一的粒徑，溶劑黏性選擇是關鍵。由于沉淀聚合法制備的分子印跡聚合物粒徑均一，顆粒小，所以在HPLC色譜柱和毛細管柱等領域得到應用。

5）表面印跡法，是在載體表面進行分子印跡聚合，使結合位點能均勻地分布在載體表面，能更好地去除或結合模板分子。此方法不僅能獲得比表面積大、粒徑均一的聚合物，而且可以通過載體的性能來適應生產(chǎn)要求，同時，它克服了傳統(tǒng)聚合方法制備的MIPs傳質(zhì)慢、結合位點包埋等問題。Yoshida M等人[23]、Tsukagoshi K人等[24]采用表面印跡法合成組氨酸分子印跡聚合物，并用其對組氨酸及衍生物進行識別。陳志萍等[25]采用表面印跡法，以硅膠微粒作為載體，合成膽紅素分子印跡聚合物，其MIPs具有優(yōu)良的選擇識別性能，解析率達到99.39%。但是，在二維網(wǎng)絡中形成印跡點導致結構穩(wěn)定性較差，結合容量減少，可重復使用次數(shù)降低[26]。

在設計分子印跡聚合物體系時，除了適合的聚合方法外，還要做好模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、溶劑 ( 致孔劑 ) 、引發(fā)劑等的選擇及確定最佳配比

2 分子印跡聚合物在高效液相色譜柱上的應用

分子印跡聚合物具有選擇性高、化學穩(wěn)定性好、耐酸堿性強、使用壽命長等特點。MIPs已被應用于高效液相色譜色譜柱中，作為其固定相。根據(jù)HPLC色譜柱固定相填料方式不同，分子印跡色譜柱分為分子印跡色譜整體柱和分子印跡色譜填充柱。

2.1 分子印跡整體色譜柱

整體柱，又稱為整體固定相連續(xù)床或連續(xù)棒，因其制備簡單、內(nèi)部結構均勻、滲透率高、傳質(zhì)速度快和易改性等特點已被廣泛應用。分子印跡整體柱是將分子印跡技術與整體柱結合，采用原位聚合法，在空的色譜柱內(nèi)直接進行聚合，得到分子印跡整體柱。

Mastui等1993年首次制備了苯丙氨酸分子印跡整體柱。雖然存在著許多不足，但是將分子印跡技術和整體柱結合的嘗試引起了人們的廣泛關注。 近年來，分子印跡整體柱被廣泛應用于手性拆分、植物提取物的分離分析、藥物提取檢測、蛋白質(zhì)分離等。

在手性物質(zhì)拆分方面，Yin Junfa等[27]采用原位聚合法，制備了那格列奈分子印跡整體柱，其能成功地拆分那格列奈及其對映體，實驗表明手性識別決定于立體結構、分子印跡官能團排列及MIPs上孔穴，手性拆分是一個熱焓可控過程。Elijan等[28]采用原位聚合物，制備了S-(-)-氨氯地平分子印跡整體柱，通過梯度洗脫，將S-(-)-氨氯地平分子及對映體分離。

在植物提取物的分離分析方面，San Han-wen等[29]采用原位聚合法制備了茶堿分子印跡整體柱，通過梯度洗脫方法，改善了色譜峰拖尾現(xiàn)象，成功測定了不同茶葉中咖啡因和茶堿的含量，分子印跡整體柱可用于植物提取物的 分離分析。尹艷鳳等[30]制備了大黃素分子印跡整體柱，優(yōu)化其色譜條件，印跡因子達到1.9，并成功從中藥大黃片分離得到大黃素。

在藥物分離檢測方面，Li Xiao Xia等[31]制備了恩諾沙星分子印跡整體柱，其能將恩諾沙星與左氧氟沙星、環(huán)丙氟沙星、加替沙星、諾氟沙星完全分離，該印跡色譜柱可用于恩諾沙星藥物的分離檢測。

在蛋白質(zhì)的分離方面，Lin Zan等[32]制備了3種不同基質(zhì)的牛血清蛋白和溶霉素分子印跡整體柱，在整體柱制備過程引入溶膠-凝膠法對硅膠骨架進行了優(yōu)化，減緩了整體柱的衰老速度，延長整體柱的使用壽命。在蛋白質(zhì)的識別過程中發(fā)現(xiàn)，分子印跡整體柱在低交聯(lián)度下對蛋白質(zhì)識別分離效果更好。Jia Man等[33]通過原位聚合法直接制備了溶酶酵素的分子印跡整體柱，其印跡因子達到5.04且能將溶酶酵素從雞蛋白中分離出來。

分子印跡整體柱由于其優(yōu)越的性能在諸多方面得到應用，但是色譜峰較寬[34-36]、柱效低[37]等問題仍未解決，分離機制也需要進一步研究。

2.2 分子印跡填充色譜柱

分子印跡填充色譜柱是指采用干法或濕法填柱法將制備好的分子印跡顆粒填充于色譜柱內(nèi)獲得分子印跡填充色譜柱。目前制備分子印跡填充色譜柱固定相的方法主要有懸浮聚合、沉淀聚合及種子溶脹聚合。這些方法可以直接制備聚合物微球，不需粉碎、研磨過程，可直接作為高效液相固定相。分子印跡填充色譜柱已經(jīng)應用于藥物的檢測分離、手性物質(zhì)的拆分等方面。

在藥物的檢測分離方面，Zhang Yan等[38]采用懸浮聚合法，制備了20～50μm氯霉素分子印跡微球，并將其作為高效液相色譜固定相，制備分子印跡填充色譜柱，通過梯度洗脫的方式，不僅能將氯霉素相似結構分離，也能將其與紅霉素和四環(huán)素分離，可用于檢測分離氯霉素。Deng Qi Liang等[39]用氫化奎寧作為偽模板，采用表面印跡法制備了氫化奎寧分子印跡聚合物，并以此為HPLC固定相，能將奎寧與奎尼丁完全分離，說明印跡微球具有手性固定相的三維孔穴，表現(xiàn)出大量的協(xié)同作用。

在手性物質(zhì)的拆分方面，Wei Shuting等[40]采用沉淀法合成100nm～3μm的 17β-雌二醇分子印跡聚合物微球，并制備了17β-雌二醇分子印跡填充柱，用于分離17β-雌二醇和17α-雌二醇，與C18相比，分子印跡填充色譜柱分離效果更好。于思明等[41]制備N-BOC-L-色氨酸分子印跡聚合物作為高效液相色譜柱固定相，對N-BOC-L-色氨酸分子進行拆分，成功將N-BOC-L-氨基酸分子和N-BOC-D-氨基酸分子對映體進行分離。

目前，分子印跡填充色譜柱雖然在藥物的提取和分離、拆分對映體等方面得到應用，但是由于空隙率低，所以還未在蛋白質(zhì)等大分子中應用。相對于整體柱，分子印跡填充色譜柱文獻報道較少，因為分子印跡填充柱的固定相要求較為嚴苛，一是固定相膨脹度必須小，若是膨脹度大，流動相進入，固定相膨脹，堵塞色譜柱，柱壓上升，高效液相無法運行；二是固定相耐壓性要好，填充色譜柱相對整體柱，空隙率低，柱壓高，固定相耐壓性差，可能造成固定相崩塌，造成色譜柱無法使用。

3 結語

分子印跡聚合物由于其特異識別、高選擇性及穩(wěn)定的物理性能在高效液相色譜得到了研究和應用。MIPs作為高效液相色譜固定相，制備的分子印跡色譜柱具有優(yōu)良的特異選擇性，但是其真正應用仍存在許多問題：1）柱效低，峰型寬且拖尾，不能準確地定量分析；2）聚合體系選擇有限，缺乏理論指導；3）對分子印跡色譜柱的作用機理和熱動力學研究較少；4）沒有統(tǒng)一評價標準。因此，還需要科技人員進行大量的研究。

[1] Won Jo Cheong, Song Hee Yang, Faiz Ali. Molecular imprinted polymers for separation science:A review of reviews[J]. J. Sep. Sci., 2013(36): 609-628.

[2] Pauling L.The serological properties of simple substances.Ⅶ .a quantitative theory of the inh ibition by haptens of the precipitation if heterogeneous antisera with antigens, and comparison with experimental results for polyhaptenic simple substances and for azoproteins[J]. J. Am. Chem. Soc., 1940,62(3): 2643-2657.

[3] Jiang Jiabing , Zhou Qi , Kang Chengcheng , et al. Preparation and Characterization of a Pseudo-Template Imprinted Polymer with a Chirality-Matching Monomer for the Separation of Cinchona Alkaloids by High-Performance Liquid Chromatography[J]. Journal of Applied Polymer Science., 2013,27(2): 3425-3431.

[4] Francisco Barahona, Esther Turiel, Peter A. G. Cormack et al. Synthesis of core-shell molecularly imprinted polymer microspheres by precipitation polymerization for the inline molecularly imprinted solid-phase extraction of thiabendazole from citrus fruits and orange juice samples[J]. J. Sep. Sci., 2011(34): 217-224.

[5] Shabi Abbas Zaidi, Won Jo Cheong. Preparation of an open-tubular capillary column with a monolithic layer of S-ketoprofen imprinted and 4-styrenesulfonic acid incorporated polymer and its enhanced chiral separation performance in capillary electrochromatography [J]. Journal of Chromatography A, 2009.16(12): 2947-2952.

[6] Ge Shenguang , Zhao Peini , Yan Mei, et al. Multi-branch chemiluminescence-molecular imprinting sensor for sequential determination of carbofuran and omethoate in foodstuff [J].Analytical Methods, 2012(4): 3150-3156.

[7] 申晴，崔莉鳳，趙碩，等.微囊藻毒素分子印跡傳感器的制備與應用[J].分析化學研究簡報，2012，40(3)：442-446.

[8] 馬秀玲，陳日耀，等.柚皮苷分子印跡膜的水相制備與識別[J].高分子學報，2010(4)： 416-422.

[9] T.A. Sergeyeva, O.A. Slinchenko, L.A. Gorbach, et al. Catalytic molecularly imprinted polymer membranes: Development of the biomimetic sensor for phenols detection [J]. Analytica Chimica Acta, 2010(659): 274-279.

[10] 郝蘭芳，陳妍，黃艷萍，等.S-萘普生印跡聚合物藥物釋放性能的研究[J].天津醫(yī)科大學學報．2009，15(3)： 345-347.

[11] Ou Junjie , Kong Liang, Pan Chensong, et al. Determination of dltetra hydropalmatine in Corydalis yanhusuobyltetrahydropalmatine imprinted monolithic column coupling with reversed-phase high performance liquid chromatography [J]. J. Chromatogr. A, 2006(1117): 163-169.

[12] 權英，薛興杰，陳夢玲，等.沙拉沙星分子印跡聚合物的制備及其性能研究[J].食品科學，2012，33 (12)：28-31.

[13] Liu Jinxiang , Deng Qiliang , Yang Kaiguang, et al. Macroporous molecularly imprinted monolithic polymer columns for protein recognition by liquid chromatography [J]. J. Sep. Sci., 2010(33): 2757-2761.

[14] Wulff G, Grobe Einsler R, Vesper W, et al. Enzymeanalogue built polymer [J]. Macromol Chem, 1977(178): 2817-2825.

[15] R.Arshady, K.Mosbach, Macromol. Chem, 1981(182): 687.

[16] G.Vlatakis, L.I.Andersson, R.Muller, K. Mosbach. Nature，1993(361): 645.

[17] Whitcombe M.J., Rodriguez M.E., Villar P, et al. A new method for the introduction of recognition site functionality into polymers prepared by molecular imprinting-synthesis and characterization for polymeric receptors fir cholesterol [J].J.Am.Chem. Soc., 1995, 117(27): 7105-7111.

[18] Mayes, A.G., Mosbach, K. Molecularly imprinted polymer beads: Suspension polymerization using a liquid perfluorocarbon as the dispersing phase [J].Anal. Chem., 1996(6 8): 3769-3774.

[19] Ansell, T.J., Mosbach, K. Molecularly imprinted polymers by suspension polymerization in perfluorocarbon liquids, with emphasis on the influence of the porogenic solvent [J]. J.Chromatography.A, 1997(787): 55-66.

[20] Henrik K, Maria K. Novel method for the synthesis of molecularly imprinted polymer bead libraries [J].Micromole Rapid Common, 2004(25): 315.

[21] Wang XB, Zheng ZH, Ding XB, et al. Synthesis of molecularly imprinted polymer particles by suspension polymerization in silicone oil[J]. Chinese Chem Lett., 2006, 17(9): 1243.

[22] Keiichi Yoshimatsu, Kristina Reimhult, Anatol Krozer, et al. Uniform molecularly imprinted microspheres and nanoparticles prepared by precipitation polymerization：The control of particle size suitable for different analytical applications [J]..Analytica Chimica Acta., 2007(84): 112-121.

[23] Yoshida M, Uezu Kazuya, Goto Masahiro, et al. Metal ion imprinted microsphere prepared by surface molecular imprinting technique using water-in-oil-in-water emulsions [J].Journal of Applied Polymer Science, 1999, 73(7): 1223-1230.

[24] Tsukagoshi K, Yu Kai Yu, Ozaki Yoshihisa, et al. Surface Imprinting：Preparation of Metal Ion-Imprinted presinspbyp Used of Complication at the Aqueous-Organic Interface [J]. ACS symposium Series, 1998, 703(1): 251-263.

[25] 陳志萍，高保嬌，楊曉峰，等.表面印跡法制備膽紅素分子印跡材料及其識別性能[J].過程工程學報，2009(2)：387-392.

[26] G.Vlatakis, L.I.Andersson, R.Muller, K. Mosbach. Nature, 1993(361): 645.

[27] Yin Junfa, Yang Gengliang, Chen Yi. Rapid and efficient chiral separation of nateglinide and its l-enantiomer on monolithic molecularly imprinted polymers[J].Journal of Chromatography A, 2005 (1090): 68-75.

[28] Elijan Amut, Qiang Fu&Qi, Fang&Rong Liu, et al. In situ polymerization preparation of chiral molecular imprinting polymers monolithic column for amlodipine and its recognition properties study [J],J Polym Res., 2010(17): 401-409.

[29] Sun Han-wen, Qiao Feng-xia, Liu Guang-yu. Characteristic of theophylline imprinted monolithic column and its application for determination of xanthine derivatives caffeine and theophylline in green tea[J]. Journal of Chromatography A, 2006(1134): 194-200.

[30] 尹艷鳳，李倦生，姚運先，等.大黃素分子印跡整體柱的合成及性能表征[J].分析測試學報，2008，27(7)：758-761.

[31] Li Xiao Xia, Liu Xin, Bai Li Hong, et al. Preparation of imprinted monolithic column under molecular crowding conditions [J]. Chinese Chemical Letters, 2011(22): 989-992.

[32] Lin Zan, Yang Fan, He Xiwen, et al. Preparation and evaluation of a macroporous molecularly imprinted hybrid silica monolithic column for recognition of proteins by high performance liquid chromatography [J]. Journal of Chromatography A, 2009, 16(12): 8612-8622.

[33] Jia Man, Qin Lei, He Xi-Wen, et al. Preparation and application of lysozyme imprinted monolithic column with dopamine as the functional monomer [J]. J. Mater. Chem., 2012(22): 707-713.

[34] Huang Xiaodong, Zou Hanfa, Chen Xiaoming, et al. Molecularly imprinted monolithic stationary phases for liquid chromatographic separation of enantiomers and diastereomers [J]. J. Chromatogr. A., 2003(984): 273-282.

[35] 楊清清，李娟，狄斌，等.黃芩素分子印跡整體柱的制備研究[J].藥物分析雜志，2011，30(1)：1-5.

[36] 張靜，賀浪沖，傅強.士的寧分子印跡整體柱的制備[J].分析化學研究簡報，2005，33(1)：113-116.

[37] 班璐.活性/可控自由基聚合的分子印跡整體柱的制備及性能評價[D].天津：天津醫(yī)科大學，2013.

[38] Zhang Yan, Lei Jiandu. Synthesis and Evaluation of Molecularly Imprinted Polymeric Microspheres for Chloramphenicol by Aqueous Suspension Polymerization as a High Performance Liquid Chromatography Stationary Phase[J]. Bull. Korean Chem. Soc., 2013, 34(6): 1839-1844.

[39] Deng Qi Liang, Li Yan Li, Zhang Li Hua. Molecularly imprinted macroporous monolithic materials for protein recognition [J].Chinese Chemical Letters, 2011 (22): 1351-1354.

[40] Wei Shuting, Alexandra Molinelli, Boris Mizaikoff. Molecularly imprinted micro and nanospheres for the selective recognition of 17-estradiol[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2006 (21): 1943-1951.

[41] 于思明，蘇立強，何丹鳳.N-BOC-L-色氨酸分子印跡聚合物的手性拆分[J].化工時代，2011，25(10)：18-20.

Molecularly Imprinted Polymer for High Performance Liquid Chromatographic Column

TANG Ping-ping, LI Hua
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530008, China)

The preparation and recognition mechanism of molecularly imprinted polymer was introduced. The application and existing problems at present of MIP as HPLC stationary phase in molecularly imprinted monolithic column and packed column were also discu ssed.

molecularly imprinted poly mer; high performance liquid; molecularly imprinted monolithic column; molecularly imprinted packed column

O 657.7+2

A

1671-9905(2014)06-0059-05

2014-04-10