木瓜蛋白酶酶解輔助提取葛根中的有效成分研究

李雅君，席小莉，張立偉，陳廷貴，王曉菊，楊頻

（山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所，山西 太原 030006）

0 引言

葛根（RadixPuerariae）系豆科植物野葛（Pueraia lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根［1］。豆科葛屬植物我國約有10種，包括野葛、峨眉葛、粉葛、食用葛、密花葛、云南葛及小花葛等。其中，野葛以其根部入藥，稱為葛根［2－3］。葛根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，素有“千年人參”美譽，具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽止瀉等功效［4］，是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上的常用藥物。葛根中的化學(xué)成分主要包括：總黃酮（異黃酮類、其他黃酮類），香豆素類，三萜類化合物，其中主要為異黃酮類化合物。

黃酮類化合物泛指兩個芳香環(huán)（A，B環(huán)），通過中央三碳相互連接而成的一系列化合物［5］，其基本母核為2－苯基色原酮（結(jié)構(gòu)式如下），B環(huán)連在2位上是黃酮類化合物，B環(huán)連在3位上是異黃酮類化合物。

葛根中有葛根素、大豆苷、3’-羥基葛根素、3’-甲氧基葛根素等30多種異黃酮成分，其中葛根素是本屬特有成分和主要有效成分。葛根素和總黃酮的含量通常被作為評價葛根質(zhì)量的主要指標(biāo)［6］。葛根素的結(jié)構(gòu)式如下。

隨著中藥現(xiàn)代化的快速發(fā)展和酶工程技術(shù)的不斷成熟［7］，由于酶的高效性、專一性、特異性強、所需條件溫和等特點，酶解技術(shù)在近些年來被廣泛地應(yīng)用于中藥提取的過程當(dāng)中［8］。由于黃酮類化合物在較高的溫度以及較高的壓力條件下非常容易分解，而酶解法條件溫和，異黃酮苷元不易變性［9］，能有效地促進(jìn)有效成分的溶出，因此酶解法作為一種新技術(shù)將為中藥的提取提供一種新途徑［10］。木瓜蛋白酶是一種較為常見且來源廣泛的植物蛋白酶，對蛋白質(zhì)、氨基酸酯以及酰胺等化合物的水解反應(yīng)都具有良好的催化活性，在食品、輕紡、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［11］。木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能保持較高活性的蛋白酶［12－14］。在中藥加工過程中，加入適量木瓜蛋白酶，能夠有效促進(jìn)藥物有效成分的煎出，提高藥效［15］。葛根中有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在提取的過程中，遇熱凝固，影響其他有效成分的浸出。因此可在提取前用木瓜蛋白酶對其進(jìn)行預(yù)處理，將蛋白質(zhì)水解成多肽及氨基酸類，遇熱不再凝固，從而促進(jìn)各種有效成分的增加。木瓜蛋白酶的作用范圍很廣，水解溫度為10℃～80℃，在p H值3～9的范圍內(nèi)對底物均有作用，且穩(wěn)定性好［16］。曾惠芳［17］曾做過這樣的實驗，用木瓜蛋白酶預(yù)處理補骨脂后煎提，從而提高了補骨脂有效成分的煎出。木瓜蛋白酶酶解輔助提取葛根中的有效成分尚鮮見報道，本文次選用木瓜蛋白酶酶解的方法，對葛根中的有效成分進(jìn)行了輔助提取，并確定了其最佳提取工藝條件。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；微型高速萬能試樣粉碎機（黃燁市齊家容科學(xué)儀器廠）；Varian Cary Win UV（美國Varian公司）；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（余姚市東方電工儀器廠）；OHAUS CP114電子天平（奧豪斯儀器有限公司）。

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；葛根（山西晉城中晉有限公司）；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司）；木瓜蛋白酶（索萊寶科技有限公司）；Tris（北京索萊寶科技有限公司）；HCl（信陽市化學(xué)試劑廠）；磷酸（天津市化學(xué)試劑六廠）；甲醇（色譜純）；娃哈哈純凈水。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根素含量的HPLC測定

色譜條件：色譜柱為 Venusil XBP C18（2）（4.6×250 mm，5μm），（天津博納艾杰爾科技有限公司），檢測波長為250 nm，柱溫為25℃，流動相為甲醇：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%磷酸水溶液（25∶75），流速為1 m L／min。

精密稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)樣品5 mg于25 m L的容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，備用。以此為母液，依次配制0.040 0、0.080 0、0.120 0、0.160 0、0.200 0 g／L 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件分別對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行含量測定。以葛根素的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積AU為縱坐標(biāo)，繪制HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝－0.0866＋48.21X，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 0。

1.2.2 葛根總黃酮含量的UV測定

分別配制0.004 0、0.006 0、0.008 0、0.010 0、0.012 0 g／L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用紫外分光光度計分別測定其在250 nm處的吸光度。以葛根素的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制UV標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝81.234 7X＋0.014 8，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 9。

1.2.3 葛根中有效成分的提取方法

將葛根切片，晾干，粉碎。準(zhǔn)確稱取1 g的葛根粉末，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的木瓜蛋白酶、4 m L p H＝6的Tris-HCl緩沖液，在55℃下恒溫酶解4 h后，加入50%的乙醇，水浴回流提取2 h，抽濾，將濾液定容于50 m L容量瓶中，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將葛根素標(biāo)準(zhǔn)液在紫外可見分光光度計上進(jìn)行200～800 nm全波段掃描，最大吸收波長就是檢測波長，見圖1。

2.2 葛根素HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葛根素質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積（AU）為縱坐標(biāo)，作圖得到葛根素的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

Fig.1 UV wavelength scan of puerarin圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)品全波長掃描圖

Fig.2 HPLC standard curve of puerarin圖2 葛根素HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 葛根素UV標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葛根素質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，作圖得到葛根素的UV標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。

2.4 單因素實驗

葛根有效成分的得率受很多因素的影響，本文主要對酶解時間、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解p H值、酶解溫度四個影響因素進(jìn)行了單因素考察，并確定了最佳的酶解條件。

2.4.1 酶解時間

在p H＝6，酶解溫度T＝55℃，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω＝2.5%的條件下①楊小玲：《木瓜蛋白酶酶解提取葛根中的總黃酮》，確定其最佳酶解時間。以酶解時間為橫坐標(biāo)，得率為縱坐標(biāo)作圖（如圖4）。

Fig.3 The UV standard curve of puerarin圖3 葛根素UV標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4 Effect of enzymolysis time on the ratio of puerarin and flavonoids圖4 酶解時間對葛根素和葛根總黃酮得率的影響

由圖4可得，隨著木瓜蛋白酶對葛根酶解時間的延長，葛根中有效成分的得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)酶解時間為4 h時，葛根中有效成分的得率達(dá)到最大；然而當(dāng)酶解時間超過4 h后，葛根中有效成分的得率均開始出現(xiàn)不同程度的下降，這可能是由于酶與葛根中有效成分長時間的相互作用，葛根中的有效成分被木瓜蛋白酶分解所致。因此，最佳酶解時間為4 h。

2.4.2 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)

在酶解溫度T＝55℃，p H＝6，酶解時間t＝4 h的條件下，確定其最佳酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω為橫坐標(biāo)，得率為縱坐標(biāo)作圖（如圖5）。

Fig.5 Effect of enzyme mass fraction on the ratio of puerarin and flavonoids圖5 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葛根素和葛根總黃酮得率的影響

由圖5可得，隨著木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，葛根中有效成分的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時，葛根中有效成分的得率達(dá)到最大；然而當(dāng)木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2.5%時，隨著木瓜蛋白酶的繼續(xù)加入，葛根中有效成分的得率開始下降，這可能是由于木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，過量的酶將葛根素和葛根總黃酮中的部分糖苷鍵分解，從而使得有效成分的得率下降［18］。因此，最佳的酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%。

2.4.3 酶解p H值

在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω＝2.5%，酶解溫度T＝55℃，酶解時間t＝4 h的條件下，確定其最佳酶解p H值。以酶解p H為橫坐標(biāo)，得率為縱坐標(biāo)作圖（如圖6）。

由圖6可得，隨著p H值的增大，葛根中有效成分的得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在p H＝6時，葛根中有效成分的得率達(dá)到最大。這可能是由于木瓜蛋白酶在p H＝6時活性最高（即木瓜蛋白酶的最適p H為6）；當(dāng)偏離它的最適p H值時，木瓜蛋白酶的活性就會下降，從而引起葛根中有效成分得率的下降。因此，木瓜蛋白酶的最佳酶解p H值為6。

2.4.4 酶解溫度

在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω＝2.5%，酶解p H＝6，酶解時間t＝4 h的條件下，確定其最佳酶解溫度。以酶解溫度T為橫坐標(biāo)，得率為縱坐標(biāo)作圖（如圖7）。

Fig.6 Effect of enzymolysis p H value on the ratio of puerarin and flavonoids圖6 酶解p H值對葛根素和葛根總黃酮得率的影響

Fig.7 Effect of enzymolysis temperature on the ratio of puerarin and flavonoids圖7 酶解溫度對葛根素和葛根總黃酮得率的影響

由圖7可得，對于葛根素，當(dāng)溫度低于55℃時，隨著溫度的升高，葛根素的得率增加；當(dāng)溫度達(dá)到55℃時，葛根素的得率最大；當(dāng)溫度超過55℃后，葛根素的得率出現(xiàn)先下降后上升的趨勢：下降的原因可能是由于溫度超過55℃后，木瓜蛋白酶的活性降低甚至喪失；而上升的原因可能是隨著溫度的繼續(xù)上升葛根素的溶出速度不斷加快。

對于葛根總黃酮，當(dāng)溫度低于55℃時，隨著溫度的升高，葛根總黃酮的得率增加；當(dāng)溫度達(dá)到55℃時，葛根總黃酮的得率最大；當(dāng)溫度超過55℃后，葛根總黃酮的得率持續(xù)下降，這可能是由于溫度超過55℃后，木瓜蛋白酶的活性降低甚至喪失，而且溫度對葛根總黃酮的溶出速度影響比較小。因此，得出酶解的最佳溫度為55℃。

通過上述分析得出：采用木瓜蛋白酶酶解輔助提取葛根中有效成分的最佳工藝條件是：酶解時間t＝4 h，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω＝2.5%，酶解p H＝6，酶解溫度T＝55℃。

2.5 正交試驗

2.5.1 正交試驗設(shè)計

選取酶解時間、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度為考察因素，每個因素選擇3個水平，按L9（34）正交表進(jìn)行設(shè)計，如表1所示。

表1 正交因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthodoxy

2.5.2 綜合加權(quán)評分法評價

分別稱取葛根1 g，按L9（34）正交表得出的條件進(jìn)行試驗。酶解后水浴加熱回流提取，減壓抽濾得到濾液，分別對葛根素和葛根總黃酮的含量進(jìn)行測定，通過計算得到葛根素和葛根總黃酮的得率，最后進(jìn)行多指標(biāo)綜合評價。綜合評價［19］是利用數(shù)學(xué)方法（包括數(shù)理統(tǒng)計方法）對一個復(fù)雜系統(tǒng)的多個指標(biāo)信息進(jìn)行分析處理，以求得其優(yōu)劣等級的一種評價方法。綜合評分要以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再給出不同的權(quán)重。根據(jù)指標(biāo)因素對得率影響的貢獻(xiàn)大小的差異給予分配權(quán)重系數(shù)，由于葛根素和葛根總黃酮得率的影響相當(dāng)，因此將葛根素和葛根總黃酮的權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.5，再進(jìn)行加權(quán)求和，綜合評分（Y）＝0.5X1／Xmax1＋0.5X2／Xmax2，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

對各因素進(jìn)行直觀分析，表2中因素A（酶解時間）的K值：K2＞K1＞K3；因素B（酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的K值：K1＞K3＞K2；因素C（酶解溫度）的K值：K3＞K2＞K1；說明最優(yōu)水平為：A2B1C3。在所選因素水平范圍內(nèi)，因素A的極差R最大，因此酶解時間是主要影響因素；其次是因素B和C，故各因素對有效成分得率的影響程度依次為A＞B＞C。

由方差分析結(jié)果可得出，各因素對實驗結(jié)果均無顯著性影響。因此，木瓜蛋白酶酶解輔助提取葛根中有效成分的最佳條件為A2B1C3，即酶解時間4 h，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，酶解溫度為60℃。

2.5.3 驗證試驗

由于最佳條件組合A2B1C3不在正交表中，需對其進(jìn)行正交驗證試驗。葛根素得率為2.201%，葛根總黃酮得率為10.61%。

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