一個中國遺傳性血色病家系致病基因的突變分析

李元豐，張紅星，張海濤，彭曉波，白麗麗，賀福初，邱澤武，周鋼橋

1.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，北京 102206;

2.中國人民解放軍第三〇七醫(yī)院中毒救治，北京 100071;

3.蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206;

4.國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京)，北京 102206

遺傳性血色病(Hereditary hemochromatosis, HHC)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，最常見于北歐白種人群，發(fā)病率可達 0.5%[1]。該病在中國人群中的發(fā)病率較低，但至今尚無確切的流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)。HHC患者由于遺傳缺陷，導(dǎo)致過多的鐵進入血循環(huán)，進而引起鐵逐漸在肝臟、胰腺 和心臟等多種器官中沉積，并最終損傷器官功能。HHC的臨床表現(xiàn)為皮膚色素沉著、肝硬化、糖尿病、心律失常、心功能衰竭、垂體損傷、睪丸萎縮和關(guān)節(jié)疾病等。

目前已發(fā)現(xiàn)有5個基因的突變可能導(dǎo)致遺傳性血色病，分別是 HAMP、HJV(HFE2)、TFR2、FPN和HFE[2]。根據(jù)不同的遺傳病因，可將HHC分為4種類型[3]：1型為HFE突變所致的血色病，故又被稱為HFE相關(guān)血色病，絕大多數(shù)遺傳性血色病屬于該類型；2型為HJV基因和HAMP基因突變所致的血色病，其中前者被進一步劃分為2A型，后者被劃分為2B型；3型為TFR2基因突變所致的血色病；4型為FPN基因突變所致的血色病。

本研究收集了我國安徽省的一個近親婚配家系，并使用全外顯子組測序技術(shù)檢測了先證者及其 1個無癥狀堂(表)弟的外周血基因組DNA上的罕見突變，對該家系的致病基因進行了定位。

1 對象和方法

1.1 血色病患者及所在家系的臨床和社會人口學(xué)資料

患者(先證者)來自安徽省渦陽縣，男性，漢族，29歲。2012年12月因“出現(xiàn)皮膚發(fā)黑、腹脹、胸悶、憋氣等癥狀”就診。實驗室檢查發(fā)現(xiàn)：鐵蛋白含量為1650 ng/mL、總膽紅素為46.6 μmol/L、直接膽紅素為20.6 μmol/L。臨床診斷為心肌病，全心功能不全IV級，房室傳導(dǎo)阻塞，疑為血色病。進一步診治及既往史調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病人性功能喪失已10年，脾臟腫大，患2型糖尿病，不排除肝硬化的可能性。上述臨床表現(xiàn)及檢查結(jié)果提示該病人患有血色病。

圖1 遺傳性血色病家系示意圖

患者父母為姑表近親結(jié)婚(圖1)，該家系的遺傳關(guān)系均得到確認。家系中其他成員暫未出現(xiàn)明顯的血色病癥狀。本研究經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)執(zhí)行，所有受試者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA的提取

抽取血色病患者(Ⅲ-1)和其他4名家系成員(Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4和Ⅲ-5)的外周靜脈全血，用常規(guī)得飽和酚、氯仿法抽提基因組 DNA，乙醇沉淀保存待用。該家系的其余成員未提供外周血樣。

1.2.2 HFE c.845G>A突變的檢測與分析

為檢測先證者是否攜帶與血色病最為密切相關(guān)的 HFE基因的常見致病 c.845G>A(p.C282Y，該突變導(dǎo)致HFE蛋白第282位半胱氨酸 C被酪氨酸Y取代[p.C282Y])，本文采用 PCR擴增、產(chǎn)物純化和Sanger測序法對先證者的基因組 DNA進行了突變分析。PCR擴增覆蓋突變所在的基因組區(qū)域，上游引物為：5′-GGGTATTTCCTTCCTCCAACC-3′，下游引物為：5′-AATTACCTCCTCAGGCACTCC-3′。測序結(jié)果與野生型 HFE基因的標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank：NC_000006.12)比對，以確定該病例是否攜帶HFE c.845G>A突變。

1.2.3 全外顯子組測序

本文對先證者(Ⅲ-1)和家系成員Ⅲ-4的基因組DNA進行了外顯子區(qū)域的捕獲和高通量測序。外顯子區(qū)域捕獲使用的試劑盒為 SureSelect人全外顯子V5 + UTR(Agilent公司)，大約覆蓋人類基因組70 Mb區(qū)域。使用高通量測序儀Hiseq 2000進行雙端100 bp的高通量測序(Illumina公司)。

1.2.4 序列比對、變異檢測和注釋

使用 Trimmomatic軟件(v0.32)去除低質(zhì)量的高通量測序數(shù)據(jù)，使用 BWA軟件(v0.5.9)將高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)與參考基因組(hg19)進行比對，使用GATK軟件(v2.8-1)檢測單堿基變異(SNV)和插入/缺失(Indel)。使用ANNOVAR對變異進行注釋。保留目標(biāo)區(qū)域中能改變氨基酸的突變(包括錯義突變、無義突變、基因編碼區(qū)內(nèi)微小的插入缺失和可變剪接區(qū)的突變)，并去除數(shù)據(jù)庫中已知的單核苷酸多態(tài)性(Single-nucleotide polymorphism, SNP)，包括dbSNP135數(shù)據(jù)庫中的常見 SNP、千人基因組計劃中亞洲人的SNP以及NHLBI外顯子組測序項目中的常見SNP。通過以上分析、過濾和質(zhì)量控制，最終獲得個體中攜帶的具有潛在功能意義的罕見突變。

1.2.5 突變危害性的預(yù)測

使用SIFT(http://sift.jcvi.org/www/SIFT_chr_coords_submit.html)和PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/bgi.shtml)軟件，預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響程度。僅當(dāng)兩種軟件均預(yù)測同一突變對蛋白質(zhì)的功能影響較大時，才認定該突變具有較強的危害性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病例中未檢測到HFE基因c.845G>A突變

前人已有報道，HFE基因上的純合突變或復(fù)合雜合型突變是導(dǎo)致遺傳性血色病的常見原因，在遺傳性血色病患者中，HFE基因 c.845G>A純合突變發(fā)生頻率最高(該突變可導(dǎo)致HFE蛋白發(fā)生p.C282Y的改變)，約占遺傳性血色病患者總數(shù)的80%～85%[4]。通過 Sanger測序，發(fā)現(xiàn)血色病患者(Ⅲ-1)并不攜帶p.C282Y突變，從而排除該患者所患疾病是由p.C282Y純合突變引起的，從而提示需要通過進一步的檢測，以確定該血色病患者的其它致病突變。

2.2 全外顯子組測序的深度及覆蓋度

本文對先證者(Ⅲ-1)及另一家系成員(Ⅲ-4)的外周血基因組DNA進行了全外顯子組測序。與參考基因組(hg19)比對后的結(jié)果顯示，血色病患者Ⅲ-1及家系成員Ⅲ-4的平均測序深度分別達到 101.2×和111.7×，目標(biāo)區(qū)域在 10×以上的比例達到 96%以上，說明全基因組范圍內(nèi)的編碼區(qū)和非翻譯區(qū)(Untranslated region，UTR)基本被有效覆蓋(表1)。

2.3 在先證者中檢測到 HJV(HFE2)基因存在兩個純合突變

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該血色病患者在多個基因上攜帶純合或雜合突變。在目前已知的與HHC相關(guān)的5個基因(HAMP、HJV、TFR2、FPN和HFE)中，HAMP、TFR2、FPN和 HFE未發(fā)生基因突變。但是，在 HJV基因上發(fā)生了兩個純合突變，分別為c.G18C和c.GC962_963AA，通過Sanger測序進一步證實了這兩個純合突變(圖2A和2B)。其中,第一個突變能夠引起HJV蛋白第6位谷氨酰胺被組氨酸取代(p.Q6H)。但是，通過生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該位點保守性差，突變引起的危害性小(SIFT和PolyPhen-2軟件預(yù)測均提示危害性較小)，因此推測該突變不是致病性突變。第二個突變?yōu)檫B續(xù)的兩個堿基突變，引起HJV蛋白的翻譯在第321位被提前終止(p.C321X)，該突變造成HJV蛋白缺少尾部的糖基化磷脂酰肌醇(Glycosilphosphatidylinositol，GPI)錨定結(jié)構(gòu)域，具有很強的危害性。此外，通過檢查本實驗室內(nèi)部的 148個不患血色病的個體的高通量測序數(shù)據(jù)集，未能發(fā)現(xiàn)c.G18C和c.GC962_963AA這兩個突變。由此推測，HJV基因上的c.GC962_963AA(p.C321X)純合突變可能是血色病患者Ⅲ-1的致病性突變。

表1 測序深度統(tǒng)計

圖2 HJV基因的突變

表2 病例中攜帶的純合突變(除HJV基因突變外)

2.4 先證者的其它純合突變

除目前已知的與遺傳性血色病相關(guān)的 5個基因外，其他基因上的突變是否可能是血色病患者Ⅲ-1的致病突變？為此，本文進一步分析了該血色病患者攜帶的所有突變?？紤]到該患者的父母為近親結(jié)婚，推斷該患者更有可能是由相關(guān)基因上的純合突變引起的，而非復(fù)合雜合型突變，故以下僅關(guān)注純合突變。

本文發(fā)現(xiàn)，除HJV基因上的2個純合突變外，該患者攜帶其他 12個純合突變(表 2)。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這 12個突變的危害性均不強(兩種預(yù)測軟件同時預(yù)測突變危害性強時才認定該突變危害性強)，且突變所在基因的功能與鐵代謝之間的關(guān)系未見報道。因此，該患者攜帶的其他突變引發(fā)血色病的可能性比較低。

綜上，HJV基因上的純合突變c.GC962_963AA(p.C321X)很可能是血色病患者Ⅲ-1的致病性突變。由此，從遺傳學(xué)上推測該患者所患疾病為2A型血色病。事實上，該患者的臨床表現(xiàn)為發(fā)病年齡低，性功能喪失，全心功能不全，均符合2A型血色病的特點。

2.5 家系成員Ⅲ-4的全外顯子組測序分析

家系成員Ⅲ-4(23歲)的轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度正常，但是該個體具有精子不液化等異常癥狀。為了嘗試從遺傳學(xué)上確定家系成員Ⅲ-4是否患有遺傳性血色病，我們對該個體也進行了全外顯子組測序。Ⅲ-4與血色病患者Ⅲ-1的親緣關(guān)系非常近(圖1)，如果該個體也患有遺傳性血色病，則一般情況下，該個體應(yīng)攜帶與血色病患者Ⅲ-1一致的純合突變 c.G18C和c.GC962_963AA(p.Q6H/p.C321X)。經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)該個體確實攜帶與血色病患者Ⅲ-1一致的突變c.G18C和c.GC962_963AA，但均為雜合性突變(圖2)。此外，該個體在HJV基因上不存在其它突變。該個體在其他4個已知的與遺傳性血色病相關(guān)的基因上也不存在突變。因此，根據(jù)現(xiàn)有的遺傳學(xué)知識，本文無法確定家系成員Ⅲ-4是否患有遺傳性血色病。

2.6 其他家系成員的突變分析

本文進一步對該家系第Ⅲ代其余3名成員也進行了 c.G18C(p.Q6H)和 c.GC962_963AA(p.C321X)突變的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，家系成員Ⅲ-2為野生型純合子，Ⅲ-3和Ⅲ-5為雜合子(圖2)。目前，家系成員Ⅲ-3和Ⅲ-5表現(xiàn)型均正常，但考慮到二者年齡較低(24歲和 22歲)，是否患有遺傳性血色病尚需要進一步的觀察。此外，本文注意到該家系第Ⅲ代的每一名成員均同時攜帶p.Q6H和p.C321X突變，或者既不攜帶p.Q6H也不攜帶p.C321X突變，提示p.Q6H與致病性的p.C321X突變呈連鎖不平衡狀態(tài)，處于同一等位基因上。

3 討 論

遺傳性血色病是一種罕見的常染色體隱性遺傳病。目前已發(fā)現(xiàn)5個鐵代謝相關(guān)基因(HAMP、HJV、TFR2、FPN和 HFE)上的突變能夠?qū)е卵?。其中，HFE基因上的突變最早被報道[6]，且該基因上的突變是遺傳性血色病發(fā)病的主要原因[7]。遺傳性血色病患者在HFE蛋白上的突變主要為p.C282Y純合突變、p.C282Y/p.H63D復(fù)合雜合型突變和p.C282Y/p.S65C復(fù)合雜合型突變[2]。這些突變在高加索人群中比較常見，但在我國人群中非常罕見[8]，本研究中的血色病患者也不存在p.C282Y等突變。

本研究對同一家系的兩名個體(其中一例為血色病患者)進行了全外顯子組深度測序。結(jié)果顯示，該家系中血色病患者的 HJV基因攜帶純合突變p.C321X，提示該患者所患疾病為2A型血色病，其臨床表型證實了該推測。

HJV mRNA主要在肝臟、心臟和骨骼肌中表達。其中，肝實質(zhì)細胞內(nèi)HJV的表達對鐵調(diào)素(Hepcindin)的分泌具有重要的調(diào)節(jié)功能，進而維持機體內(nèi)鐵代謝的平衡[9]。HJV存在附著型(Membrane form，m-HJV)和可溶性(Soluble form，s-HJV)兩種形式，當(dāng)附著型 HJV尾部的糖基磷脂肌醇(GPI)錨定結(jié)構(gòu)域被剪切掉后，可形成可溶性 HJV。兩者對鐵調(diào)素的調(diào)節(jié)功能是反向的。其中附著型HJV作為骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)的共受體，可通過BMP/SMAD通路上調(diào)鐵調(diào)素的表達；而可溶性HJV可與附著型HJV競爭性結(jié)合BMP，導(dǎo)致鐵調(diào)素的表達下調(diào)。近年來，在血色病患者體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種不同的HJV突變[10]。其中多種HJV突變可顯著降低附著型HJV的表達水平。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，攜帶HJV突變時，鐵調(diào)素的表達異常降低[11]，這進一步提示了HJV突變在血色病發(fā)生中的作用。

Huang等[12]曾報道過HJV突變p.C321X存在于一名中國年輕女性遺傳性血色病患者中。不同于本研究的是，Huang等[12]在患者中檢測到的突變p.C321X為雜合型，來源于其表型正常的母親。該突變型等位基因與來源于表型正常的父親的另一HJV突變型等位基因(p.I281T)形成復(fù)合雜合子，最終導(dǎo)致遺傳性血色病。其中，p.I281T純合突變已被報道能導(dǎo)致血色病[10]。p.C321X突變與以往報道的p.R326X突變的功能類似，二者均可引起HJV蛋白缺失尾部的糖基磷脂肌醇(GPI)錨定結(jié)構(gòu)域，進而形成可溶性HJV，最終引發(fā)鐵代謝異常[13]。

最近，Li等[14]報道了一名中國中年男性血色病患者攜帶雜合型HJV突變型等位基因p.C321X，該突變型等位基因來源于其健康的母親。但是，該患者不攜帶其他的HJV基因突變，也不攜帶其他血色病相關(guān)基因(HAMP、TFR2、FPN和 HFE)的突變，這一結(jié)論與以往血色病是隱性遺傳病的認識相悖。Li等進一步分析患者所在家系的其他成員，發(fā)現(xiàn)患者的一名姐姐和一名哥哥也從其母親處繼承了攜帶p.C321X突變的等位基因。有意思的是，患者的這名哥哥疑似患有血色病，而其姐姐身體健康。因為以往從未報道過健康男性攜帶p.C321X這一突變型等位基因，由此Li等認為基因和環(huán)境因素共同影響疾病的發(fā)生，攜帶一個異常HJV等位基因(p.C321X)的男性也有很大可能患血色病，但發(fā)病年齡可能比攜帶HJV基因純合突變或復(fù)合雜合性突變的患者要晚；而攜帶一個異常等位基因p.C321X的女性則基本不會發(fā)病。

本研究中，血色病患者Ⅲ-1攜帶HJV純合突變型等位基因 p.C321X，同時排除了其他基因上的突變可能導(dǎo)致該病。由此，本文首次報道了純合 HJV突變型等位基因p.C321X可引起血色病。進一步對該家系其他成員進行突變檢測后發(fā)現(xiàn)，該家系第Ⅲ代成員中的另外兩名男性個體Ⅲ-3(24歲)和Ⅲ-4(23歲)均攜帶p.C321X雜合突變。這兩名男性個體轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度正常，但是Ⅲ-4具有精子不液化等異常表型，且Ⅲ-3和Ⅲ-4年齡均較小。鑒于Li等[14]曾發(fā)現(xiàn)兩名中國中年男性攜帶p.C321X雜合突變可導(dǎo)致血色病，因此不排除本研究中的兩名青年男性今后罹患血色病的可能性。同時本文發(fā)現(xiàn)，該家系第Ⅲ代成員的一名女性個體Ⅲ-5也攜帶p.C321X雜合突變。結(jié)合 Huang等[12]和 Li等[14]的研究，推測該女性個體血色病的發(fā)病風(fēng)險較低，但不排除其男性后代罹患血色病的可能性，需要密切關(guān)注。該家系第Ⅲ代成員的另一名女性個體Ⅲ-2是野生型純合子，故該個體罹患遺傳性血色病的風(fēng)險較低。此外，由于血色病患者Ⅲ-1及其妹妹(Ⅲ-2)和弟弟(Ⅲ-3)分別為p.C321X突變型純合子、野生型純合子和雜合子，因此，雖然其父母沒有提供外周血DNA用于本項研究，但是我們?nèi)匀荒軌蚋鶕?jù)孟德爾遺傳定律推斷其父母(Ⅱ-1和Ⅱ-2，表型正常)均攜帶一個 p.C321X突變的等位基因。這一點若能得到實驗證實，將首次提示存在一例健康老年男性攜帶p.C321X雜合突變，從而提示只攜帶一個p.C321X突變等位基因不一定使男性患血色病。

綜上，本研究首次在來自一個中國近親結(jié)婚家系的血色病患者中檢測到HJV p.C321X純合突變。結(jié)合 Huang等[12]和 Li等[14]的研究，目前共在 3個中國血色病家系中發(fā)現(xiàn)了p.C321X突變，提示p.C321X這兩個突變在中國人群中存在，但其發(fā)生頻率較低。進一步在中國人群中特別是安徽和江蘇一帶的中國人群中篩查p.C321X突變，將有可能對中國血色病的致病機制和基因診斷研究發(fā)揮重要作用。

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