響應面分析法優(yōu)化松蘿多糖提取工藝的研究

孫長霞，蘇印泉，張柏林

(1.北京林業(yè)大學理學院，北京100083;2.西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西楊凌712100;3.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京100083)

松蘿是松蘿科松蘿屬的一種地衣植物，在西藏，新疆，黑龍江等地均有分布。松蘿具有清熱解毒、止咳、化痰、消炎等功效，很早便被用于醫(yī)藥領域，研究表明地衣植物的活性一定程度上與地衣多糖的含量有直接關系［1－3］。近年來，據(jù)國外文獻報道，地衣多糖具有很高的抗癌活性，而這種多糖的抗癌作用是通過提高健康細胞的免疫能力，抑制癌細胞的病態(tài)增殖，從而克服了一些抗癌藥物對健康細胞的損傷副作用，即所謂的“中間宿主免疫性”［4－5］。目前已報道的松蘿多糖提取受提取溫度、提取時間等多個因素的影響，但已有模型只是簡單的描述單個因素對松蘿多糖得率的影響，各因素間交互作用描述的很少，為了更好的了解各因素間對松蘿多糖得率的影響，有必要建立多個因素數(shù)學模型以描述對松蘿多糖得率的影響［6－9］。本文通過響應面分析法進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析，研究了提取時間、提取溫度、液/料比與松蘿多糖提取含量之間關系的數(shù)學模型，并對模型進行了檢驗，為松蘿的研究開發(fā)及中藥現(xiàn)代化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗皮松蘿(Usnea.montis－fuji)2005年8月采自于陜西秦嶺火地塘，經(jīng)由西北植物所黎斌老師進行鑒定松蘿科松蘿屬地衣植物，樣品除去枯枝、葉梗、破損葉及其它地衣雜物后剪碎，置于真空干燥箱中在50℃條件下干燥12h，放入封口塑料袋中密封保存，備用。

乙醇，丙酮，氯仿等試劑均為分析純;UV－2000紫外－可見分光光度計 河南兄弟儀器設備有限公司;SENOC－R旋轉蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋 廣州北銳精密儀器有限公司;FA－2004型電子天平 上海恒平科學儀器有限公司;SHD－Ⅲ型循環(huán)水泵 北京中教金源科技有限公司;ZDF－5型真空干燥箱 南京天煌機械有限公司。

1.2 實驗方法

以粗皮松蘿為研究對象，采用脫脂后熱水浸提法對粗皮松蘿中的多糖進行提取，具體工藝流程如下:準確稱取一定量的事先處理好的粗皮松蘿樣品，氯仿索氏提取至無色;然后熱水浸提脫脂液、抽濾、減壓濃縮、乙醇沉淀、乙醇和丙酮洗滌、真空干燥，得粗皮松蘿粗多糖。

1.2.1 單因素實驗 按照上述方法提取松蘿多糖，選取液/料比(20∶1，30∶1，40∶1，50∶1)，提取溫度(60、70、80、90、100℃)，提取時間(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00h)等因素進行單因素實驗，以多糖提取含量為考察指標，探究各因素對松蘿多糖提取含量的影響。在上述單因素實驗確定的最佳提取時間、液/料比和提取溫度下，準確稱取一定量的粗皮松蘿，然后考察浸提次數(shù)依次為1、2、3、4和5次時對松蘿多糖提取效果的影響，以多糖提取含量作為考察指標，確定松蘿多糖提取過程中的最佳提取次數(shù)。

1.2.2 中心組合實驗設計 在上述單因素實驗的基礎上，選取松蘿多糖提取過程中影響較大的3個因素［10－11］，提取時間、提取溫度和液/料比作為考察因素，每個因素三個水平，采用響應面分析法建立三因素二次回歸正交旋轉組合設計實驗。根據(jù)central composite design，CCD的中心組合原理設計實驗［12－13］，設 3 個自變量 z1、z2和 z3分別代表提取溫度、提取時間、液/料比，每個自變量的上、下水平分別為zri和z－ri，根據(jù)各實驗因素的水平范圍，按公式1進行編碼，經(jīng)過這種量綱唯一的編碼轉換，所有變量的取值都是+1和－1，它們在所研究的區(qū)域范圍內都是平等的［14－15］，列出的因素水平編碼表，結果見表2。

在此基礎上，可以列出因素水平的編碼表，結果見表1。

1.2.3 松蘿多糖含量的測定(苯酚－硫酸法)本文采用苯酚－硫酸法［16］測定多糖含量，多糖含量計算公式如下:

松蘿多糖含量(mg/g)=提取液松蘿多糖濃度(mg/mL)×體積(mL)×稀釋倍數(shù)/松蘿樣品質量(g)

1.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗數(shù)據(jù)重復測定3次，所得結果為平均值±標準差SD。實驗結果利用 DPS 11.5，SPSS和MATLAB等數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計軟件進行分析和處理［17－19］。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗優(yōu)化工藝參數(shù)

本文采用苯酚－硫酸法測定多糖含量，吸光度與多糖含量(y)的方程為:y=0.009882x－0.028，相關系數(shù)為:R2=0.9933。按照1.3.1的方法進行單因素實驗，結果見圖1～圖4。由圖1～圖4可知，當提取時間為 2.00h，提取溫度為 80℃，液/料比為 20∶1，提取次數(shù)為2次時松蘿多糖提取含量最大。

圖1 提取時間對松蘿多糖提取含量的影響Fig.1 Effect of extracting time on Usnea Polysaccharide yield

2.2 建立模型

以松蘿多糖提取含量為響應值，采用多元二次回歸方法對實驗結果進行響應分析，實驗設計及結果見表2。

表2中實驗1～8為析因點實驗，9～14為星號點的實驗，15～23為中心點實驗，其中析因點實驗為自變量取值在所構成的三維頂點;星號點實驗為自變量取值所構成的三維區(qū)域的中心點［17－19］;中心點實驗重復9次，用以估計實驗誤差。利用DPS 11.5軟件對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得響應值(y)對影響多糖提取含量關鍵因子(提取溫度x1、提取時間x2和液/料比x3)的二次多項式回歸模型見式(1)。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 The ANOVA of master regression equation

圖2 提取溫度對松蘿多糖提取含量的影響Fig.2 Effect of extracting temperature on Usnea Polysaccharide yield

圖3 液/料比對松蘿多糖提取含量的影響Fig.3 Effect of ratio of sample to water(m/m)on Usnea Polysaccharide yield

圖4 提取次數(shù)對粗皮松蘿粗多糖提取含量的影響Fig.4 Effect of times of extraction on Usnea Polysaccharide yield

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Design and data of RSM experiment

對模型(1)進行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，x1x3項的回歸分析對松蘿多糖提取含量的影響不顯著(α=0.05)，其他各項回歸系數(shù)均在不同程度上顯著;對回歸方程的F檢驗結果極顯著，這表明回歸方程能夠較好的代表實驗結果的規(guī)律。剔除不顯著項后的預測回歸方程(2):

將二次回歸正交旋轉組合設計實驗的因變量數(shù)值代入預測回歸方程(2)進行擬合，結果見表2。由表2可以看出，不同實驗條件下各擬合值與測定值之間誤差較小，說明回歸方程擬合狀況良好。

利用DPS統(tǒng)計軟件，在各因素的考察范圍之內對松蘿多糖的提取含量進行最大值求解。結果表明，提取溫度在零水平(80℃)，提取時間在1.682(3.00h)，液/料比在 1.682(40∶1)時，松蘿多糖提取含量最高，達到81.29mg/g。對求取的最佳提取條件進行實驗驗證，實驗結果的平均值為80.16 mg/g，驗證值接近預測值，誤差小于5%。

按照編碼值與實驗值間的轉換公式，將預測回歸方程(2)中的編碼值轉換為實際值，可以得到用實際的實驗參數(shù)來表示的松蘿多糖提取含量回歸方程(3)。

2.3 模型交互項分析

2.3.1 單因素效應 對預測回歸模型進行方差分析，其F值大小依次是x2＞x3＞x1，即影響松蘿多糖提取的各因素重要順序依次為:提取時間、液/料比、提取溫度。利用DPS 11.5軟件對預測回歸方程(3)進行單因素效應分析，結果見圖5。

圖5 提取時間、提取溫度、液/料比對粗皮松蘿粗多糖提取含量的影響Fig.5 Effect of extraction time，extration temperature，ratio of sample to water(m/m)on extraction efficiency of Usnea Polysaccharide

由圖5可知，在松蘿多糖提取過程中，粗多糖提取含量隨提取溫度的增加而增大，到達零水平附近(提取溫度80℃)時松蘿多糖提取含量最高;當提取溫度再增加時，則松蘿多糖提取含量反而下降。液/料比和提取時間對松蘿多糖提取的影響是兩條平滑上升且趨于平緩的曲線，液/料比和提取時間分別達到0.5水平附近(液/料比是32∶1，提取時間是2.21h)時粗多糖提取含量最高;而后隨著液/料比和提取時間的增加，松蘿多糖提取含量趨于平緩。

2.3.2 交互效應分析 利用DPS 11.5軟件對預測回歸方程(3)進行交互效應分析，結果見圖6～圖8。

圖6 提取溫度、提取時間對松蘿多糖提取含量的影響Fig.6 Effects of extraction time，extraction temperature on Usnea Polysaccharide yield

圖7 提取溫度、液/料比對松蘿多糖提取含量的影響Fig.7 Effects of extraction temperature，ratio of sample to water(m/m)on Usnea Polysaccharide yield

圖8 提取時間、液/料比對松蘿多糖提取含量的影響Fig.8 Effects of extraction time，ratio of sample to water(m/m)on Usnea Polysaccharide yield

由圖6可知，在提取時間一定的情況下，松蘿多糖的提取含量隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)一種拋物線的規(guī)律，即在提取溫度80℃之前，松蘿多糖的提取含量隨提取溫度的增加而增大;當提取溫度達到80℃之后，繼續(xù)增加提取溫度則松蘿多糖提取含量反而下降。提取時間比較短的情況下，提取溫度對多糖提取的影響表現(xiàn)的尤為顯著。在圖中所示的每一個提取溫度下，松蘿多糖提取含量隨提取時間呈現(xiàn)一種不斷增加的趨勢，在提取時間2.50h之前，隨著提取時間的延長松蘿多糖提取含量增加;在提取時間超過2.50h之后，隨著提取溫度的增長松蘿多糖提取含量緩慢下降。

從等值線圖可以看出，隨著提取溫度和提取時間的增加，松蘿多糖的提取含量迅速增加，提取溫度和提取時間之間的交互作用比較顯著。同時可以看出，在提取溫度為77～86℃，提取時間1.80～2.50h這個區(qū)間之內，松蘿多糖的提取含量最高(提取含量大于70.00mg/g)。

從圖7可以看出，在提取溫度一定的情況下，松蘿多糖的提取含量隨著液/料比的增加呈現(xiàn)一種拋物線的規(guī)律，即在液/料比達到30∶1之前，松蘿多糖的提取含量隨液/料比的增加而增加;當液/料比超過30∶1之后，繼續(xù)增加液/料比松蘿多糖提取含量反而降低。在圖中所示的每一個液/料比下，松蘿多糖提取含量隨提取溫度呈現(xiàn)一種不斷增加的趨勢，提取溫度達到80℃之前，隨著提取溫度的升高松蘿多糖提取含量逐漸增加;在提取溫度超過80℃之后，隨著液/料比的增長松蘿多糖提取含量緩慢下降。

從等值線圖可以看出，隨著提取溫度和液/料比的增加，松蘿多糖的提取含量緩慢增加，提取溫度和液/料比之間的交互作用比較顯著。同時可以看出，在提取溫度為 77～86℃，液/料比為 27∶1～40∶1，這個區(qū)間之內，松蘿多糖的提取含量最高(提取含量大于70.00mg/g)。

從圖7可以看出，在液/料比較低的情況下，松蘿多糖的提取含量隨著提取時間的增加而呈現(xiàn)一種不斷增加的趨勢。即隨著提取時間的增加，松蘿多糖提取含量逐漸增加。而在液/料比較高的情況下，松蘿多糖的提取含量隨提取時間的增加變化不大。同樣在提取時間比較短的情況下，松蘿多糖提取含量和液/料比之間也存在一種類似與拋物線的關系。即隨著液/料比的增加松蘿多糖的提取含量變化不大。但是在提取時間較長的情況下，松蘿多糖提取含量隨著液/料比的增加不斷增加，與單因素實驗結論一致。

從等值線圖可以看出，松蘿多糖的提取含量隨著提取時間和液/料比的增加而顯著增加，因此液/料比和提取時間之間存在著強烈的交互作用。在提取時間為2.41～3.00h，液/料比為 34∶1～40∶1 的情況下，松蘿多糖的提取含量顯現(xiàn)出最大值(大于70.00mg/g)。

3 結論

在單因素實驗的基礎上應用響應面分析法優(yōu)化了松蘿多糖的提取工藝參數(shù)，建立了松蘿多糖提取含量與提取過程中的關鍵因素(提取溫度、提取時間和液/料比)之間的二次多項式回歸模型，經(jīng)檢驗該模型合理可靠，同時利用該模型對松蘿多糖提取過程中的關鍵因素進行單因素及交互效應分析，得出松蘿多糖提取關鍵因素的優(yōu)化參數(shù)為:提取溫度80℃，提取時間 3.00h，液/料比40∶1 時，松蘿多糖提取含量最高，達到80.16 mg/g。

［1］Elin S O，Kristin I，Polysaccharides from lichens:structural characteristics and biological activity［J］.Planta Medica，2001，67:199－208.

［2］岳金玫，蒲彪，陳安均，等.響應面法優(yōu)化塊菌多糖的提取工藝［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(19):271－274.

［3］Teixeira AZA，Iacomini M，Gorin PAJ.Chemotypes of mannosecontaining polysaccharides oflichen mycobionts:a possible aid in classification and identification［J］.Carbohydrate Research，1995:266:309－314.

［4］張琳，樊金玲，朱文學，等.響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取甘草多糖工藝［J］.食品科學，2010，31(16):67－71.

［5］Takeda T，F(xiàn)unatsu M，Shibata S.Polysaccharides of lichens and fungiV.Antitumoractive polysaccharidesofEvernia，pacroscyphus and Alectoria species［J］.Chemical ￡Pharmaceutical Bulletin，1972，20:2445－2449.

［6］Shibata S.Polysaccharides of lichens［J］.Journal of the National Science Council of Sri Lanka，1973，1:183－188.

［7］Gorin PA，Iacomini M.Polysaccharides of the lichens Cetraria isIandica and Ramalina usnea［J］.Carbohydrate Research，1984，128:119－132.

［8］Nishikawa Y，Takeda T，Shibata S.Polysaccharides in lichens and fungiⅢ.Further investigation on the structures and the antitumor activity of the polysaccharides from Gyrophora esculenta Miyoshi and Lasailla papulosa(Ach.)Llano［J］.Chemical ￡Pharmaceutical Bulletin，1969，17:1910－1916.

［9］Leao AMAC，Buchi DF，Iacomini M，et al.Cytotoxic effect against HeLA cells of polysaccharides from the lichen Ramalina celastri［J］.Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology 1997，29(4):503－509.

［10］Takahashi K，Kon K，Yokota I，et al.Chemotaxonomic studies on the polysaccharides of lichens.Polysaccharides of Stereocaulaceous lichens［J］.Carbohydrate Research，1981，89:166－173.

［11］張軍偉，傅大放，彭奇軍，等.響應面法優(yōu)化酸水解稻稈制木糖的工藝參數(shù)［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2009，25(11):253－257.

［12］Yokota I，Shibata S.A polysaccharide of the lichen Stereocaulon japonicum［J］.Chemical￡ Pharmaceutical Bulletin，1978，26:2668－2670.

［13］Franz G.Polysaccharides in pharmacy:Current applications and future concepts［J］.Planta Medica，1989，55:493－497.

［14］Nishikawa Y，Ohno H.Studies on the water－ soluble constituents of lichens.Ⅳ.Effect of antitumor lichen－glucans and related derivatives on the phagocytic activity of the reticuloendothelial system in mice［J］ .Chemical ￡Pharmaceutical Bulletin，1981，29(11):3407－3410.

［15］Preston JF，Gander JE.Isolation and partial characterization of the extracellular polysaccharides of Penicillium charlesii［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1968，124:504－512.

［16］張惟杰.復合多糖生化研究技術［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1987，10－11.

［17］李亞娜，林永成，佘志剛.響應面分析法優(yōu)化羊棲菜多糖的提取工藝［J］.華南理工大學學報(自然科學版)，2004，32(11):28－32.

［18］王慧娜，趙樺.響應面法優(yōu)化開口箭多糖超聲提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(13):187－193.

［19］Olafsdottir ES，Omarsdottir S，Smestad Paulsen B，et al.Rhamnopyranosylgalactofuranan，a new immunologically active polysaccharide from Thamonolia subuliformis［J］.Phytomedicine，1999，6(4):273－279.