林丹、毒死蜱對淡水藻類毒性效應的比較研究

鄧惜汝，鮮啟鳴，孫成

污染控制與資源化研究國家重點實驗室//南京大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210023

農(nóng)藥正越來越廣泛的運用于生產(chǎn)中，并且品種不斷增加，用量不斷增大。目前我國農(nóng)藥使用以有機氯及有機磷殺蟲劑為主，它們對生態(tài)系統(tǒng)的安全造成了很大的威脅，有機氯（磷）農(nóng)藥進入水環(huán)境后往往通過浮游植物的吸收而積累，隨后經(jīng)過食物鏈的傳遞、擴大，對水資源的開發(fā)利用造成損害（蔡道基，1999）。

林丹是一種高效廣譜的殺蟲劑，曾經(jīng)被許多國家包括中國大量使用。林丹不易降解，在土壤和沉積物中能長期殘留，2005年11月于日內(nèi)瓦召開的持久性有機污染物審查委員會第一次會議審議了將林丹列入《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》的提案，認定林丹符合所有《公約》規(guī)定的篩選標準（岳瑞生，2001）。許多國家在20世紀70年代已停止林丹的使用，我國從 1983年起停止生產(chǎn)，但作為其他家藥的原料還保留著少量的生產(chǎn)。而毒死蜱作為傳統(tǒng)的廣譜、高效、低殘留、毒性相對較低的殺蟲劑品種，其市場潛力被普遍看好，目前，全球毒死蜱的市場年銷售量約為14萬t，國內(nèi)市場毒死蜱的市場年需求量約為2萬t左右。毒死蜱雖然在中國迎來了發(fā)展機遇，但是毒死蜱在生產(chǎn)和使用過程中極易造成水、大氣、土壤、動植物污染及通過生物富集對人類健康造成威脅等一系列問題（Rack，1993）。

隨著對農(nóng)藥污染認識的深入，農(nóng)藥對生態(tài)系統(tǒng)的毒性及其機制的研究不斷增多，但過去大多報道集中于農(nóng)藥對鳥類、無脊椎類動物、魚類、哺乳動物的影響及其毒理學研究，對于豐富而重要的微生物的研究卻很少（Gonazlez等，2012）。然而，在日常施用農(nóng)藥的過程中，只有約 1%的農(nóng)藥作用于靶生物，其余的或殘留于土壤，或通過徑流進入水域，影響土壤和水體中的生物（沈國興等，1999）。由于藻類構成了水生食物鏈的基礎，為無脊椎動物、魚類、水鳥等生物提供氧氣和食物，因此，開展農(nóng)藥對藻類毒性效應的研究是很有必要的。作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，藻類具有結構簡單、代謝速度快、對環(huán)境變化反應敏捷等特點，且具有同高等生物相似的物理化學特性和酶作用過程，常作為河流環(huán)境理化指標的指示生物（Kobrael和White，1996）。藻類生長抑制試驗是毒理學生物測定的方法之一，該方法成本低，可在相對較短的時間內(nèi)評價化學品的毒性，提供有意義的毒性指標，預測化學物質(zhì)進入環(huán)境可能引起的危害（Rack，1993）。

本實驗以長江中下游常見的3種淡水藻類銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和梅尼小環(huán)藻(Cyclotella meneghiniana)為受試生物，測定了林丹和毒死蜱對藻類的7 d生長抑制曲線，得到相應的半抑制質(zhì)量濃度(EC50)，最低有顯著影響有效質(zhì)量濃度(LOEC)、最高無顯著影響有效質(zhì)量濃度(NOEC)及最大可接受毒性質(zhì)量濃度(MATC)。研究結果可為評價林丹及毒死蜱的生態(tài)風險提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、梅尼小環(huán)藻(Cyclotella meneghiniana)，均購于中科院武漢水生所淡水藻種庫；林丹（純度w=99.3%）、毒死蜱（純度w=100%）均購自AccuStandard, Inc.，USA，實驗所用試劑均為分析純。主要儀器有熒光顯微鏡、智能光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、冷凍離心機、高壓滅菌器、紫外-可見分光光度計、血球計數(shù)板等。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

銅綠微囊藻和普通小球藻采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)（陳國永等，2007），梅尼小環(huán)藻采用D1培養(yǎng)基培養(yǎng)（楊海明等，1997）。實驗前先對藻種進行馴化，將其置于光照強度2000 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度為25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每月轉(zhuǎn)接1次。通過鏡檢能夠明顯區(qū)分3株藻種的形態(tài)。

1.2.2 生物量測定

為了準確快速地獲得藻細胞的生物量，實驗中選用吸光度值來表示3種藻的生長量。將銅綠微囊藻、普通小球藻和梅尼小環(huán)藻的藻液稀釋至不同質(zhì)量濃度，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計算藻細胞數(shù)，同時用分光光度計在680 nm處測量對應藻液的吸光度，可得到藻細胞數(shù)與吸光度之間的線性關系。見表1，其中y表示藻液的A680，x表示藻細胞數(shù)(104cells·mL-1)。

表1 3種藻吸光度與藻細胞數(shù)間的關系Table 1 The relationship between cell number and absorbance

1.2.3 藻類毒性試驗

取生長處于對數(shù)期的藻液，接種到新鮮滅過菌的培養(yǎng)液中，混勻，記錄下起始藻吸光度，然后分裝到三角瓶中，分別加入不同質(zhì)量濃度梯度的林丹(0，50，89，158，281，500 μg·L-1)和毒死蜱(0，500，890，1580，2810，5000 μg·L-1)，每個質(zhì)量濃度設置 3個平行，用封口膜封口后放入光照強度 2000 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度為25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24 h測定藻液在最大吸收波長處的吸光度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗選用抑制藻類 50%生長的化合物的有效質(zhì)量濃度96 h-EC50，最低有顯著影響有效質(zhì)量濃度LOEC、最高無顯著影響有效質(zhì)量濃度NOEC以及最大可接受毒性質(zhì)量濃度 MATC值作為評價指標。通過 A計算相對抑制率，相對抑制率=(1-N/N0)×100%，其中，N為試驗組的藻密度，N0對對照組的藻密度（劉梅和劉贊，1998）。利用概率單位-質(zhì)量濃度對數(shù)法，根據(jù)毒物質(zhì)量濃度的自然對數(shù)和生物效應的百分率單位成直線關系這一原理，利用化合物質(zhì)量濃度的自然對數(shù)與抑制百分率之間的相關性方程計算EC50值（Hoekstra，1991）。利用化合物質(zhì)量濃度的自然對數(shù)與抑制百分率之間的相關性方程計算EC20和EC10值，計算得出的EC20可作為LOEC值，EC10可作為NOEC值。最大可接受毒性質(zhì)量濃度 MATC等于最低有顯著影響質(zhì)量濃度 LOEC和最高無顯著影晌質(zhì)量濃度NOEC的幾何平均值，即MATC=(LOEC*NOEC)1/2而計算得出。統(tǒng)計分析用Excel 2007與Origin 8.5軟件完成。

2 結果與分析

用不同質(zhì)量濃度的林丹處理3種淡水藻，林丹對銅綠微囊藻及小球藻的抑制率變化如圖1-A—圖1-B，由于梅尼小環(huán)藻對50~500 μg·L-1的林丹不敏感（圖1-C），為了計算林丹、毒死蜱對梅尼小環(huán)藻的毒性值，將受試質(zhì)量濃度范圍調(diào)整為 500~5000 μg·L-1，林丹對梅尼小環(huán)藻的抑制率變化如圖1-D。

從圖1可知，在林丹的毒性作用下，藻細胞的生長受到不同程度的抑制作用，且抑制程度在一定的線性范圍內(nèi)與林丹的質(zhì)量濃度呈正相關，顯示出明顯的質(zhì)量濃度-劑量相關性。同時，用肉眼可以看出培養(yǎng)在含有不同質(zhì)量濃度林丹的培養(yǎng)基中的藻類生長情況不同。對照組中，3種藻均生長旺盛，藻液顏色正常，隨著時間的增長，藻液的顏色逐漸加深且少有沉淀。而在林丹處理后的培養(yǎng)基中生長的3種藻均隨著林丹質(zhì)量濃度的增加，藻液的顏色明顯比對照組淺，沉淀現(xiàn)象嚴重。

圖1 林丹對3種淡水藻類的抑制率變化圖Fig.1 The growth inhibition of algae by Lindane

根據(jù)圖 1的數(shù)據(jù)，利用前面介紹的概率單位-質(zhì)量濃度對數(shù)法得到回歸方程y=ax+b，其中，y為概率單位，x為質(zhì)量濃度對數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計分析，林丹對3種藻的EC50、LOEC、NOEC及MATC值如表2所示。

從表2可以看出，銅綠微囊藻和普通小球藻對林丹的敏感性明顯高于梅尼小環(huán)藻，先前也有報道指出，不同藻類對農(nóng)藥的敏感性有較大差異。陳碧鵑等（1997）報道了氰戊菊酯和胺菊酯對等鞭金藻的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(96 h EC50)為 1.38和 0.73 mg·L-1；而對小球藻的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(96 h EC50)為0.52和1.12 mg·L-1。從而可以看出，小球藻對氰戊菊酯的敏感性要高于等鞭金藻，對胺菊酯的敏感性低于等鞭金藻。Sabater和Carrasco（2001）研究了噠嗪硫磷對 2種小球藻和 1種藍綠藻(Pseudanabaena galeata)和2種柵藻的影響，發(fā)現(xiàn)2種柵藻比小球藻和藍藻對噠嗪硫磷敏感。且本實驗中計算值與 U.S.EPA 的毒性數(shù)據(jù)庫（http://cfpub.epa.gov/ecotox/）中報道的林丹對銅綠微囊藻的 ρ(LOEC)=300 μg·L-1相近。

不同質(zhì)量濃度的毒死蜱處理3種淡水藻，3種藻的生長抑制率變化如圖2-A—圖2-C。

從圖 2可知，在當加入低質(zhì)量濃度的毒死蜱(500 μg·L-1)時，毒死蜱對銅綠微囊藻和普通小球藻的生長具有一定的促進作用，當加入的毒死蜱的質(zhì)量濃度增加時，逐漸開始對藻的生長表現(xiàn)出抑制作用。隨著加入的毒死蜱的質(zhì)量濃度的升高及3種藻在毒死蜱中暴露時間的增加，毒死蜱的抑制作用越明顯。由此可以看出低質(zhì)量濃度的毒死蜱對藻細胞的生長具有促進作用，而高質(zhì)量濃度的毒死蜱則對3種藻的生長具有抑制作用，表現(xiàn)出質(zhì)量濃度-劑量相關性。有許多研究表明，低質(zhì)量濃度的殺蟲劑可促進藻類生長。劉梅和劉贊（1998）以普通小球藻為試驗對象，研究了低質(zhì)量濃度的有機磷農(nóng)藥樂果對其生長的影響，結果顯示，低質(zhì)量濃度樂果能使普通小球藻的生長量、蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量、堿性磷酸酶活力等有明顯的增長。鄒立等（1998）也發(fā)現(xiàn)有些殺蟲劑在低質(zhì)量濃度時對海洋亞心形扁藻有一定限度的促生長作用。

表2 林丹對3種藻的毒性數(shù)據(jù)值Table 2 The toxicological datas of Lindane on algae

圖2 毒死蜱對3種淡水藻類的抑制率變化圖Fig.2 The growth inhibition of algae by Chlorpyrifo

根據(jù)圖2中的數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計分析，毒死蜱對3種藻的EC50、LOEC、NOEC及MATC值如表3所示。從表3可以看出，3種淡水藻對毒死蜱的敏感性強弱依次為銅綠微囊藻、普通小球藻和、梅尼小環(huán)藻。

比較表2和表3的毒性數(shù)據(jù)可知，林丹對藻類的毒性高于毒死蜱對藻類的毒性，如林丹及毒死蜱對銅綠微囊藻的EC50值分別為0.44和2.7 mg·L-1，說明不同的農(nóng)藥對藻類的毒性作用是不同的。鄒立等用我國常見的 11種有機磷殺蟲劑對海洋亞心形扁藻的毒性效應的研究表明，有機磷農(nóng)藥的質(zhì)量濃度越高，對扁藻生長的抑制作用越強；他還發(fā)現(xiàn)，有機磷農(nóng)藥的毒性大小還與其結構有關（鄒立等，1998）。鄒立和李永祺用 QSAR模型分析也表明，一般農(nóng)藥的親脂性越強，電子密度越大，立體結構越復雜，對藻類的致毒效應越大（鄒立和李永祺，1999）。高玉榮（1995）研究了殺蟲劑單甲脒對綠藻斜生柵藻和蛋白核小球藻的毒性作用，結果表明，同一殺蟲劑對不同藻類的毒性也不同。Sabater和 Carrasco（2001）、蔡阿根等（1999）、熊麗等（2002）、Wonk 和 Chang（1988）以及龔瑞忠等（2001）的報道也證實了這一點。

3 結論

總的來說，林丹和毒死蜱這兩種典型的有機氯/磷農(nóng)藥對3種淡水藻類均具有一定的毒性效應，且表現(xiàn)出質(zhì)量濃度-劑量相關性。就兩種不同農(nóng)藥而言，林丹對藻類的毒性高于毒死蜱對藻類的毒性，且低質(zhì)量濃度的毒死蜱對藻類的生長具有一定的促進作用，質(zhì)量濃度增加后顯示出抑制作用，這可能與這兩種農(nóng)藥的親脂性及化學結構有關。而就 3種受試的淡水藻類而言，對于林丹及毒死蜱的敏感性：銅綠微囊藻＞普通小球藻＞梅尼小環(huán)藻，說明不同藻類對農(nóng)藥的敏感性有較大差異。林丹和毒死蜱對于淡水藻類毒性差異的原因和機制還有待于進一步的研究。

表3 毒死蜱對3種藻的毒性數(shù)據(jù)值Table 3 The toxicological datas of Chlorpyrifo on algae

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