三角褐指藻和小球藻營(yíng)養(yǎng)成分的對(duì)比分析

王曉燕，邢 歡，鐘韻山，宋東輝，徐仰倉(cāng)

(天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一種單細(xì)胞微藻，生活在近海水域，易養(yǎng)殖，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、色素、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]．現(xiàn)階段，三角褐指藻僅作為動(dòng)物飼料的原料，應(yīng)用領(lǐng)域較為狹窄[2]．三角褐指藻也曾被認(rèn)為是生產(chǎn)二十碳五烯酸(EPA)[3-4]和生物柴油[5-6]的潛在生物，但過(guò)高的加工成本限制了其在該領(lǐng)域的應(yīng)用．

小球藻(Chlorella vulgaris)也是一種單細(xì)胞微藻，同樣含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、色素、維生素、多不飽和脂肪酸等生理活性物質(zhì)[7]，它的保健功效已被人們廣泛認(rèn)識(shí)[8-9]．目前，小球藻已應(yīng)用于飼料、環(huán)保、食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域．本文比較了小球藻和三角褐指藻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，從營(yíng)養(yǎng)角度分析了三角褐指藻的開(kāi)發(fā)潛力，旨在使人們充分認(rèn)識(shí)三角褐指藻的營(yíng)養(yǎng)保健功能．

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)方法

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所王廣策研究員饋贈(zèng)，藻接種在 f/2培養(yǎng)基上，22,℃、1,000,lx光照(光/暗周期為14,h/10,h)下培養(yǎng)．小球藻(Chlorella vulgaris)由本研究室保存，藻接種在BG-11培養(yǎng)基上，25,℃、4,000,lx光照(全光照)下培養(yǎng)．從接種后的第 2天開(kāi)始，用顯微鏡觀察法對(duì)培養(yǎng)液中的微藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)．

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[10]測(cè)定微藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量．用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.2.2 總糖含量的測(cè)定

采用蒽酮比色法[11]．準(zhǔn)確吸取藻液 40,mL，5,000,r/min離心 10,min，去除上清液．藻泥凍融破碎3次后，加入 3,mL磷酸緩沖溶液，沸水中加熱30,min，取 1,mL加入 0.1,mL硫酸鋅溶液，沸水浴5,min后，立即加入亞鐵氰化鉀溶液 0.1,mL，5,000,r/min離心 10,min，取上清液 1,mL于 4,mL蒽酮中，沸水浴 10,min，冷水迅速冷卻至室溫，測(cè)定620,nm處的吸光度．用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.2.3 游離氨基酸的測(cè)定

采用茚三酮顯色法[12]測(cè)定微藻細(xì)胞中的游離氨基酸含量．用亮氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.2.4 不飽和脂肪酸含量的測(cè)定

采用氣相色譜法．準(zhǔn)確稱取 80,mg真空冷凍干燥的藻粉于 10,mL螺口玻璃試管中，加入 2,mol/L KOH-CH3OH 2,mL，75,℃水浴中皂化 30,min，冷卻至室溫，加入 3,mol/L HCl-CH3OH 2,mL，75,℃水浴中甲酯化 15,min，冷卻至室溫，加入 l mL正己烷和少量的蒸餾水萃取脂肪酸．用 GC-7890Ⅱ型氣相色譜儀(日本島津公司)測(cè)定不飽和脂肪酸的含量．色譜條件：色譜柱為強(qiáng)極性柱(長(zhǎng)50,m，內(nèi)徑 0.2,mm)，柱溫 200,℃，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，溫度 280,℃，載氣為氮?dú)?，流?1,mL/min，分流比 50∶1．標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司，是由19種脂肪酸甲酯組成的混合物．用面積歸一法計(jì)算不飽和脂肪酸含量．

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò) SPSS 19.0比較組間差異，采用 One Way ANOVA法中的 LSD比較不同組間的差異性(P＜0.05時(shí)差異顯著)．?dāng)?shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值．

2 結(jié)果與分析

2.1 三角褐指藻和小球藻生長(zhǎng)速率的比較

三角褐指藻是海水藻，而小球藻是淡水藻．它們的生長(zhǎng)環(huán)境不同，對(duì)培養(yǎng)基、溫度等條件的要求也不相同．要比較這兩種微藻的生長(zhǎng)速率，必須在各自的最優(yōu)生長(zhǎng)條件下比較．為此，首先探索了兩種微藻的最佳培養(yǎng)條件：三角褐指藻為 f/2培養(yǎng)基、22,℃、1,000,lx光照(光/暗周期為 14,h/10,h)，而小球藻為BG-11培養(yǎng)基、25,℃、4,000,lx光照(全光照)．兩種微藻都是游離生長(zhǎng)的單細(xì)胞藻類，其生長(zhǎng)速率可由培養(yǎng)液中藻細(xì)胞密度的變化來(lái)衡量．三角褐指藻和小球藻生長(zhǎng)曲線如圖 1所示．三角褐指藻細(xì)胞增殖最快的時(shí)期是在接種后的2～6,d，細(xì)胞密度的日增長(zhǎng)率在 18.2%～23.3%；6,d后細(xì)胞增殖率逐漸變?。?2,d后藻細(xì)胞停止增殖，此時(shí)培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞密度最大，為 9.6×106,mL-1，與接種初相比，細(xì)胞密度增大了4.8倍．小球藻細(xì)胞增殖最快的時(shí)期是在接種后的2～7,d，細(xì)胞密度的日增長(zhǎng)率在 14.6%～50.0%；7,d后細(xì)胞增殖率逐漸變?。慌囵B(yǎng) 12,d時(shí)的細(xì)胞密度為2.31×107,mL–1，與接種初相比，細(xì)胞密度增大了 6.6倍．由此可見(jiàn)，小球藻的生長(zhǎng)速率高于三角褐指藻，平均生長(zhǎng)速率是三角褐指藻的2.4倍，說(shuō)明在相同的時(shí)間內(nèi)，養(yǎng)殖小球藻可獲得較多的生物量(P＜0.05).在需要通過(guò)生物量才能體現(xiàn)效果的領(lǐng)域，如污染環(huán)境中重金屬的吸附，小球藻的優(yōu)勢(shì)要高于三角褐指藻．

圖1 三角褐指藻和小球藻生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

2.2 三角褐指藻和小球藻糖含量的比較

糖含量是衡量食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高低的重要指標(biāo)之一．就單個(gè)細(xì)胞而言，三角褐指藻的糖含量高于小球藻的(圖 2)，前者是后者的 2.71倍，說(shuō)明三角褐指藻具有產(chǎn)生較多糖的潛力；但是，能否為人類提供較多的糖，不僅與單細(xì)胞的糖含量有關(guān)，還與該生物的生物量有關(guān)．為此，對(duì)兩種微藻在 1個(gè)生長(zhǎng)周期(12 d)內(nèi)累積的總糖量進(jìn)行測(cè)定，三角褐指藻積累的總糖量達(dá)到了 106.6,μg/mL，是同齡小球藻的 1.13倍(圖2)．結(jié)果表明，用相同的時(shí)間養(yǎng)殖三角褐指藻獲得的糖要多于小球藻的(P＜0.05)．

圖2 三角褐指藻和小球藻總糖含量比較Fig.2 Comparison of sugar content between Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

2.3 三角褐指藻和小球藻可溶性蛋白和游離氨基酸含量的比較

蛋白質(zhì)是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)組分，也是細(xì)胞多種功能的執(zhí)行者，而氨基酸又是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，因此蛋白質(zhì)和氨基酸是衡量食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)．檢測(cè)停滯生長(zhǎng)前期藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、游離氨基酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞中三角褐指藻的蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量均高于小球藻，分別為小球藻的 25.3倍和 2.9倍(圖 3)．在 1個(gè)生長(zhǎng)周期中，三角褐指藻能形成 8.6,μg/mL的蛋白質(zhì)和 26.2,μg/mL的游離氨基酸，而小球藻則能形成 0.82,μg/mL的蛋白質(zhì)和21.7,μg/mL的游離氨基酸，可見(jiàn)三角褐指藻累積的蛋白質(zhì)和游離氨基酸比小球藻的多(P＜0.05)．蛋白質(zhì)和氨基酸的總和代表了人體所能利用的總營(yíng)養(yǎng)氮．通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻的總營(yíng)養(yǎng)氮是小球藻的1.55倍，說(shuō)明三角褐指藻能為人類提供更多的營(yíng)養(yǎng)氮．

圖3 三角褐指藻和小球藻蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量比較Fig.3 Comparison of protein and free amino acids contents between Phaedactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

2.4 三角褐指藻和小球藻色素含量的比較

植物細(xì)胞中的色素主要有葉綠素和類胡蘿卜素，前者又包括葉綠素a和葉綠素b．葉綠素是人體合成血紅素的原料之一，類胡蘿卜素具有清除人體自由基的功能[13]．為此，對(duì)三角褐指藻和小球藻的色素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示．

圖4 三角褐指藻和小球藻色素含量比較Fig.4 Comparison of pigment content between Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

單細(xì)胞小球藻的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量分別是三角褐指藻的 87.3%、159%和 49.7%.結(jié)果表明，除葉綠素 b外，單細(xì)胞小球藻的其他兩種色素含量均低于三角褐指藻．1個(gè)生長(zhǎng)周期后，小球藻中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的累積量分別為三角褐指藻的 210%、383%和 120%．由此可見(jiàn)，盡管單細(xì)胞中三角褐指藻的葉綠素 a和類胡蘿卜素含量高于小球藻(P＜0.05)，但因小球藻生長(zhǎng)速率高，在1個(gè)生長(zhǎng)周期后，小球藻中色素的含量均超過(guò)了三角褐指藻(P＜0.05)，但各色素的超出程度不同，類胡蘿卜素的高出量最?。虼耍瑑H從色素角度考慮，特別是從葉綠素角度考慮，小球藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值要高于三角褐指藻．

2.5 三角褐指藻和小球藻不飽和脂肪酸含量的比較

二十碳五烯酸(EPA)(C20∶5)是一種長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，在營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化、防治心血管疾病、減輕炎癥等方面起著十分重要的作用[14]．采用前述方法測(cè)定了兩種微藻中EPA的含量，1個(gè)生長(zhǎng)周期后，三角褐指藻累積了8.12,mg/g的EPA，而小球藻幾乎檢測(cè)不到EPA(表1，圖5)，說(shuō)明三角褐指藻的EPA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小球藻(P＜0.05)．前人也報(bào)道了類似的結(jié)果[15–16]．由此可見(jiàn)，在同一時(shí)期內(nèi)，養(yǎng)殖三角褐指藻獲得的 EPA要比養(yǎng)殖小球藻多得多．另外，三角褐指藻的棕櫚油酸(C16∶1)含量也明顯高于小球藻(P＜0.05)；但小球藻的油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)、二十碳烯酸(C20∶1)含量卻明顯高于三角褐指藻(P＜0.05)(表 1)，說(shuō)明在累積不飽和脂肪酸方面，兩種微藻各有側(cè)重．

表1 三角褐指藻和小球藻不飽和脂肪酸含量比較Tab.1 Comparison of unsaturated fatty acid content between Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

圖5 三角褐指藻和小球藻脂肪酸氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of fatty acid of Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

3 討 論

小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、礦物質(zhì)和色素等，具有多種保健和藥理作用[7,16–17]．我國(guó)已將小球藻批準(zhǔn)為新資源食品[9]．小球藻作為營(yíng)養(yǎng)功效食品已經(jīng)被人們廣泛認(rèn)識(shí)[8]．本文以小球藻為參照物，分析了三角褐指藻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量．就單個(gè)細(xì)胞而言，小球藻的葉綠素 b含量高于三角褐指藻．葉綠素 b是天線色素，在細(xì)胞中負(fù)責(zé)光線的吸收和傳遞[18]，較多的葉綠素 b能夠吸收較多的光能，從而使植物能夠適應(yīng)強(qiáng)光環(huán)境．這可能是小球藻的最佳培養(yǎng)條件中光照度高于三角褐指藻的原因所在．葉綠素 b的含量高，吸收、固定的光能就多，光合作用的產(chǎn)物也多，這些產(chǎn)物能夠?yàn)樯顒?dòng)提供更多的能量，因而生長(zhǎng)速率也快，最終導(dǎo)致小球藻的生長(zhǎng)速率高于三角褐指藻．

單細(xì)胞三角褐指藻的多數(shù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量高于小球藻，說(shuō)明三角褐指藻具有高效生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的潛力；但這并不代表人們能夠獲得較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的總量是由單位細(xì)胞中的含量和生物量?jī)蓚€(gè)因素決定的．本文檢測(cè)了 1個(gè)生長(zhǎng)周期中兩種微藻累積的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)總量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三角褐指藻的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、多糖、EPA及棕櫚油酸的含量高于小球藻，說(shuō)明三角褐指藻提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)總量要比小球藻多．

小球藻的葉綠素 b、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸含量高于三角褐指藻．植物中的色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，前者的含量是后者的 3倍，因此，類胡蘿卜素比葉綠素更加稀有[19]．所以，分析食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)，類胡蘿卜素的權(quán)重要高于葉綠素．另外，油酸、亞油酸、亞麻酸都是高等植物可以合成的不飽和脂肪酸，而高等植物幾乎不能合成 EPA，因此 EPA比油酸等不飽和脂肪酸更加稀有．所以，從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的角度考慮，EPA權(quán)重要高于油酸等不飽和脂肪酸．綜上所述，在同一培養(yǎng)時(shí)期，三角褐指藻生產(chǎn)的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸及重要不飽和脂肪酸要多于小球藻，因此它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不比小球藻低．

盡管三角褐指藻易養(yǎng)殖[1,20–21]，有作為提取EPA[3–4]和生物柴油[5–6]的原料的潛力，但因加工成本高還未工業(yè)化．目前，唯一利用三角褐指藻的行業(yè)是生產(chǎn)動(dòng)物飼料[2]．據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界年銷(xiāo)售小球藻干粉2,500噸左右，有人預(yù)測(cè)[22]今后幾年內(nèi)，小球藻干粉

國(guó)際市場(chǎng)總需求量有望上升至 8,000～10,000噸．而本文研究發(fā)現(xiàn)，在相同的生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)三角褐指藻能夠生產(chǎn)出比小球藻更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)．因此，三角褐指藻的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力要強(qiáng)于小球藻．如果小球藻干粉的部分市場(chǎng)被三角褐指藻干粉替代，三角褐指藻產(chǎn)業(yè)將會(huì)獲得極大的發(fā)展．Draaisma等[23]對(duì)2011年歐洲食用油的來(lái)源進(jìn)行了研究，從土地資源、污染物的排放、水資源的消耗等方面分析了養(yǎng)殖三角褐指藻和種植油料作物的經(jīng)濟(jì)效益，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的養(yǎng)殖效益要高于后者的種植效益．據(jù)此，他預(yù)測(cè)將來(lái)歐洲市場(chǎng)的食用油有可能會(huì)被三角褐指藻等海洋硅藻油所代替．由此也看出，若三角褐指藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值被大家認(rèn)可，則它的開(kāi)發(fā)潛力將是很大的．

［1］ 蔡卓平，段舜山. 不同氮濃度下三角褐指藻生長(zhǎng)特性和化學(xué)組成[J]. 生態(tài)環(huán)境，2007，16(6)：1633-1636.

［2］ 岳偉萍. 三角褐指藻作為飼料蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)前景研究[J]. 河北漁業(yè)，2010(12)：13-14.

［3］ Otero A，García D，F(xiàn)ábregas J. Factors controlling eicosapentaenoic acid production in semicontinuous cultures of marine microalgae[J]. Journal of Applied Phycology，1997，9(5)：465–469.

［4］ 吳偉偉，高影影，隆小華，等. 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)及脂肪酸合成的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2012，31(9)：516-521.

［5］ 何峰，傅鵬程，徐春明. 三角褐指藻提取生物柴油的生態(tài)響應(yīng)研究[J]. 石油化工高等學(xué)校學(xué)報(bào)，2011，24(1)：1-5.

［6］ Lohman E J，Gardner R D，Halverson L，et al. An efficient and scalable extraction and quantification method for algal derived biofuel[J]. Journal of Microbiological Methods，2013，94(3)：235-244.

［7］ 于貞，王長(zhǎng)海. 小球藻培養(yǎng)條件的研究[J]. 煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與工程版，2005，18(3)：206-211.

［8］ 孫維寶，李龍囡，張繼，等. 小球藻的營(yíng)養(yǎng)保健功能及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué)，2010，31(9)：323-328.

［9］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 關(guān)于批準(zhǔn)蛋白核小球藻等 4種新資源食品的公告[J]. 中國(guó)食品添加劑，2013(1)：227-228.

［10］ Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

［11］ 林炎坤. 常用的幾種蒽酮比色定糖法的比較和改進(jìn)[J]. 植物生理學(xué)通訊，1989，25(4)：53-55.

［12］ 路文靜，李奕松. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2012：59-61.

［13］ 李福枝，劉飛，曾曉希，等. 天然類胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28(9)：227-232.

［14］ 胡長(zhǎng)偉，劉志禮. 富含 EPA 的海洋微藻的規(guī)?；a(chǎn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2007，26(8)：475-477.

［15］ Yen H W，Hu I C，Chen C Y. et al. Microalgae-based biorenery：From biofuels to natural product[J]. Bioresource Technology，2013，135：166-174.

［16］ 鄭雪紅，鄭愛(ài)榕. 氣相色譜法分析小球藻脂肪酸的組成[J]. 海洋科學(xué)，2012，36(6)：22-27.

［17］ Lee Y J，Hong Y J，Kim J Y，et al. Dietary Chlorella protects against heterocyclic amine-induced aberrant gene expression in the rat colon by increasing fecal excretion of unmetabolized PhIP[J]. Food and Chemical Toxicology，2013，56：272-277.

［18］ Ko S C，Kim D，Jeon Y J. Protective effect of a novel antioxidative peptide purified from a marine Chlorella ellipsoidea protein against free radical-induced oxidative stress[J]. Food and Chemical Toxicology，2012，50(7)：2294-2302.

［19］ 劉麗婭，陳山，王軍，等. 植物天然食用色素的功能及其制備工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(9)：96-100.

［20］ 蔡卓平，段舜山，朱紅惠. 氮和硅對(duì)三角褐指藻細(xì)胞增殖的交互作用研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2013，32(3)：125-129.

［21］ Acién Fernández F G，Hall D O，Ca?izares Guerrero E，et al. Outdoor production of Phaeodactylum tricornutum biomass in a helical reactor[J]. Journal of Biotechnology，2003，103(2)：137-152.

［22］ 陳曉清，蘇育才. 小球藻的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2012，37(1)：8-9.

［23］ Draaisma R B，Wijffels R H，Slegers P M，et al. Food commodities from microalgae[J]. Current Opinion in Biotechnology，2013，24(2)：169-177.