以食品級原料進(jìn)行植物乳桿菌發(fā)酵及其抗真菌活性的研究

王海寬，陳 沖，王應(yīng)東，沈發(fā)迪

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

乳酸菌用于食品和飼料中有著悠久的歷史，其可以通過降低食品 pH和產(chǎn)生有機(jī)酸、蛋白質(zhì)類活性物質(zhì)、羥基脂肪酸和酚類化合物等抑菌物質(zhì)，抑制腐敗菌和病原微生物的生長[1]．研究發(fā)現(xiàn)，部分乳酸菌具有抑制真菌生長的功能．植物乳桿菌屬于乳酸菌，據(jù)報(bào)道，也有類似抑菌功能．袁晶[2]用雙層平板拮抗法測定植物乳桿菌 ZJ316對煙曲霉有明顯的抑制作用．Crowley等[3]將植物乳桿菌作為發(fā)酵劑應(yīng)用到酸奶和橙汁中，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可延遲腐敗真菌黏質(zhì)酵母(R. mucilaginosa)的生長．Gerez 等[4]從 95 株乳酸菌中篩選出 4株具有抑制青霉菌屬、鐮孢菌屬、曲霉菌屬(霉菌來源于被污染的面包)的乳酸菌，分別為植物乳桿菌 CRL778、羅伊式乳桿菌 CRL1100、短乳桿菌 CRL772和 CRL796，并將酵母與篩選出的乳酸菌混合加入面團(tuán)進(jìn)行發(fā)酵，使生產(chǎn)出的面包保質(zhì)期延長了3,d．Yang等[5]將植物乳桿菌AF1的上清液濃縮4倍后噴到黃豆表面，與對照相比，可使黃豆表面的黃曲霉延緩7,d萌發(fā)．

以食品級原料為培養(yǎng)基經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后抗菌活性高的發(fā)酵液進(jìn)行凍干濃縮等處理作為抗真菌防腐劑直接加入食品中，由于菌株及原料皆為安全的，因此產(chǎn)生的物質(zhì)也可直接食用．這不僅滿足了消費(fèi)者對食品防腐劑的安全性要求，同時(shí)節(jié)省了新型防腐劑投入使用前進(jìn)行的安全性實(shí)驗(yàn)．此外，由于原料單一、后續(xù)操作簡單等原因使得其有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)．植物乳桿菌作為出發(fā)菌株用于酸奶和酸豆奶中已有研究[6–7]，本實(shí)驗(yàn)以脫脂奶粉及大豆蛋白為發(fā)酵培養(yǎng)基，篩選出1株對婁地青霉具有明顯抑制作用的植物乳桿菌，并對其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)特性進(jìn)行了初步探索．

1 材料與方法

1.1 菌種

60株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)均來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；婁地青霉菌(Penicillium roqueforti)購于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為 CGMCC 3.07903．

1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌活化培養(yǎng)基采用 MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10,g，牛肉膏 10,g，酵母膏 5,g，KH2PO42,g，檸檬酸三銨 2,g，乙酸鈉 2,g，葡萄糖 20,g，吐溫 80 1,mL，MgSO4·7H2O 0.5,g，MnSO4·4H2O 0.25,g，蒸餾水 1,L，pH 6.5、115,℃滅菌 20,min．

大豆蛋白培養(yǎng)基：20,g/L大豆蛋白，20,g/L葡萄糖，115,℃滅菌 15,min．

脫脂奶粉培養(yǎng)基：100,g/L脫脂奶粉，115,℃滅菌15,min．

真菌培養(yǎng)基采用 PDA培養(yǎng)基：取馬鈴薯 200,g洗凈去皮切塊，加蒸餾水 1,L煮沸約 30,min，用紗布過濾，定容至 1,L，再加葡萄糖 20,g和瓊脂 8,g充分溶解后，121,℃滅菌 20,min．

1.3 植物乳桿菌的活化培養(yǎng)和發(fā)酵液、孢子懸液的制備

1.3.1 菌株活化

取少量保存于30%甘油內(nèi)的活菌于MRS瓊脂平板上劃線，挑取單菌落用 MRS固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化傳代，從活化的 MRS固體斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體接入MRS液體培養(yǎng)基中，37,℃靜置培養(yǎng)20,h．

1.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵液的制備

從活化的種子液中按 5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，37,℃恒溫培養(yǎng)48,h后即得到乳酸菌發(fā)酵液．1.3.3 孢子懸液的制備

將接種婁地青霉的PDA斜面培養(yǎng)1周，用無菌水洗下孢子，3層擦鏡紙過濾除去菌絲得到孢子懸液．用血球記數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定孢子懸液的濃度．

1.4 抑菌活性檢測方法

1.4.1 雙層平板點(diǎn)接法[8]

按 2%接種量將活化后的菌株接種于 MRS液體培養(yǎng)基中，在厭氧箱中 37,℃液體培養(yǎng) 48,h后，吸取5,μL點(diǎn)在MRS固體平板中央，37,℃再培養(yǎng)48,h后，在平板上倒10,mL的PDA培養(yǎng)基(含有婁地青霉菌的孢子 106,mL–1)，28,℃培養(yǎng) 48,h，測量抑菌圈半徑，每個(gè)樣品 3個(gè)平行．該方法用于菌株的篩選和植物乳桿菌 IMAU10014抗真菌物質(zhì)生成的發(fā)酵特性優(yōu)化中抑菌活性的測定．

1.4.2 瓊脂平板擴(kuò)散法[9]

在滅菌的平板中倒 1層 10,mL的 PDA培養(yǎng)基(含有婁地青霉菌的孢子 106,mL–1)，待其凝固后在表面放入無菌的牛津杯(d＝7.64,mm)，將濃縮后的乳酸菌發(fā)酵上清液 100,μL接入牛津杯中，28,℃培養(yǎng)48,h，測量抑菌圈半徑，每個(gè)樣品 3個(gè)平行．該方法用于植物乳桿菌發(fā)酵濃縮上清液抑菌活性的檢測．

1.5 抗真菌活性物質(zhì)的基本性質(zhì)

1.5.1 發(fā)酵濃縮上清液的制備

從活化的種子液中按 5%接種量接種于大豆蛋白培養(yǎng)基內(nèi)，37,℃恒溫培養(yǎng) 48,h后，4,℃、10,000,r/min離心 15,min去除菌體，將上清液用 0.45,μm 無菌濾膜過濾后，–70,℃預(yù)凍 4,h后，冷凍干燥機(jī)冷凍36,h，懸浮在水中，濃縮到原始濃度的20倍，4,℃冰箱保存?zhèn)溆茫铆傊桨鍞U(kuò)散法測定其抑婁地青霉活性．1.5.2 pH對抗真菌活性物質(zhì)的影響

將原始的濃縮上清液用氫氧化鈉溶液分別調(diào)至pH 4.0、5.0、6.0、7.0，每個(gè)處理 3 個(gè)平行，盡量降低因調(diào)解 pH而引起的活性物質(zhì)濃度的變化，考察環(huán)境酸堿度對抗菌物抑菌活性的影響．

1.5.3 酶處理對抗真菌活性物質(zhì)的影響

用氫氧化鈉溶液將濃縮上清液調(diào)節(jié) pH至 7.0，分別用胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K處理，使之在37,℃水浴條件下反應(yīng)2,h，然后在100,℃水浴加熱10,min使蛋白酶變性．以不加酶處理的濃縮液作為對照，每個(gè)處理 3個(gè)平行，用瓊脂平板擴(kuò)散法測定經(jīng)過酶處理的樣品和對照的抑菌活性．

1.5.4 溫度對抗真菌活性物質(zhì)的影響

將500,μL濃縮上清液放入1.5,mL的離心管內(nèi)，分別在不同溫度下加熱1,h及121,℃加熱20,min，每個(gè)處理3個(gè)平行，將經(jīng)過以上處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品分別用瓊脂平板擴(kuò)散法測抑菌活性．

由圖1可知：當(dāng)pH＜6.5時(shí)，乳酸菌發(fā)酵液的抑菌活性隨著pH升高而遞增；當(dāng)pH達(dá)到6.5時(shí)，抑菌活性最高，其抑菌圈半徑為15.2,mm．

2.2.2 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

其他條件不變，在不同溫度下培養(yǎng) 48,h后測定發(fā)酵液的抑菌活性，結(jié)果如圖 2所示．乳酸菌發(fā)酵液的抑菌活性隨著溫度升高而遞增，溫度達(dá)到 37,℃左右抑菌活性最高，抑菌圈半徑為15.3,mm．

圖2 溫度對抑菌活性的影響Fig.2 Influence of temperature on the antifungal activity

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

從60株植物乳桿菌中篩選出對婁地青霉抑菌圈半徑＞14,mm 的 8株乳酸菌：IMAU80107、IMAU 80091、IMAU80163、IMAU80105、IMAU80158、IMAU80161、IMAU80104、IMAU10014．將其在脫脂奶粉培養(yǎng)基和大豆蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩．

當(dāng)乳酸菌的培養(yǎng)基由MRS培養(yǎng)基改為脫脂奶粉培養(yǎng)基后，其抑菌圈均在 14,mm 以下．當(dāng)培養(yǎng)基由MRS培養(yǎng)基改為大豆蛋白培養(yǎng)基時(shí)乳酸菌的抑菌活性也有所降低，僅有植物乳桿菌IMAU10014的抑菌圈半徑在14,mm以上，因此選取植物乳桿菌 IMAU 10014且培養(yǎng)基為大豆蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．

2.2 植物乳桿菌 IMAU10014抗真菌物質(zhì)生成的發(fā)酵特性優(yōu)化

為提高植物乳桿菌 IMAU10014的抑菌活性，分別選取了可能影響其抑菌效果的 pH、溫度、葡萄糖含量及大豆蛋白含量 4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)．該實(shí)驗(yàn)中菌種發(fā)酵液的抑菌活性通過

1.4.1 節(jié)雙層平板點(diǎn)接法測定．

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵液抑菌活性的影響

保持其他條件不變，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始 pH，分別培養(yǎng)48,h后測定發(fā)酵液的抑菌活性，初始pH對抑菌活性的影響如圖1所示．

圖1 培養(yǎng)基初始pH對抑菌活性的影響Fig.1 Influence of initial pH on the antifungal activity

2.2.3 葡萄糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

保持其他條件不變，培養(yǎng) 48,h后測定發(fā)酵液的抑菌活性，比較培養(yǎng)基中不同葡萄糖質(zhì)量濃度對抑菌活性的影響，結(jié)果如圖 3所示．乳酸菌發(fā)酵液的抑菌活性在葡萄糖質(zhì)量濃度為 20,g/L時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)增加葡萄糖的質(zhì)量濃度會(huì)抑制其抑菌活性．

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度對抑菌活性的影響Fig.3 Influence of glucose concentration on the antifungal activity

2.2.4 大豆蛋白質(zhì)量濃度對發(fā)酵液抑菌活性的影響

保持其他條件不變，培養(yǎng) 48,h后測定發(fā)酵液的抑菌活性，比較不同大豆蛋白質(zhì)量濃度對抑菌活性的影響，結(jié)果見表 1．培養(yǎng)基中大豆蛋白質(zhì)量濃度從10,g/L增加至 50,g/L，乳酸菌發(fā)酵液的抑菌活性無明顯差異，大豆蛋白質(zhì)量濃度在 20,g/L時(shí)其抑菌活性比其他質(zhì)量濃度時(shí)的略高．

表1 大豆蛋白質(zhì)量濃度對抑菌活性的影響Tab.1 Influence of soyabean protein concentration on the antifungal activity

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件

為進(jìn)一步提高植物乳桿菌 IMAU10014發(fā)酵豆乳培養(yǎng)基的抑菌活性，在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇各因素的3個(gè)最佳水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2. 由表2可知：4個(gè)因素的F比均小于F臨界值，因此 4個(gè)因素對其影響均不顯著．由極差分析可得對植物乳桿菌 IMAU10014抑菌效果影響主次順序是：溫度＞葡萄糖質(zhì)量濃度＞大豆蛋白質(zhì)量濃度＞pH，理論最佳組合為溫度 37,℃、pH 6.5、葡萄糖 20,g/L、大豆蛋白5,g/L，此時(shí)抑菌效果最佳．

表2 大豆蛋白培養(yǎng)基及發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of soy protein medium and fermentation condition orthogonal experiment

在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，雙層平板法檢測其對婁地青霉的抑菌活性，最終抑菌圈半徑為16.5,mm，抑菌效果與在MRS中的結(jié)果十分相近，相比于優(yōu)化前的抑菌圈半徑有顯著提高．

2.3 抗真菌活性物質(zhì)的基本性質(zhì)

為進(jìn)一步研究植物乳桿菌 IMAU10014產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的性質(zhì)，IMAU10014發(fā)酵大豆蛋白培養(yǎng)基后，分別檢測了不同 pH、溫度及酶處理后濃縮上清液的抑菌活性．

2.3.1 pH對抗真菌活性物質(zhì)的影響

pH對抗真菌活性物質(zhì)抑菌活性的影響如圖4所示．由圖 4可知，未經(jīng)處理的空白組其 pH在 3.5左右，濃縮上清液的抑菌活性隨著pH的升高逐漸降低，當(dāng) pH為 7.0時(shí)最低，但仍有抑菌活性．這說明植物乳桿菌 IMAU10014發(fā)酵大豆蛋白培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)除了酸類還有其他物質(zhì)．這一點(diǎn)與李紅娟等[10]報(bào)道的 pH對干酪乳桿菌產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)的影響一致．

圖4 pH對抑菌活性的影響Fig.4 Influence of pH value on the antifungal activity

2.3.2 酶處理對抗真菌活性物質(zhì)的影響

酶處理對抗真菌活性物質(zhì)抑菌活性的影響如圖5所示．由圖 5可以看出，中性蛋白酶處理后抑菌活性基本不變，而用蛋白酶 K和胰蛋白酶處理后活性有所降低．這說明此抑菌物質(zhì)對中性蛋白酶不敏感，對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感．因此，可初步斷定植物乳桿菌 IMAU10014發(fā)酵大豆蛋白培養(yǎng)基產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)中含有蛋白類物質(zhì)．

圖5 酶處理對抑菌活性的影響Fig.5 Influence of enzyme on the antifungal activity

有關(guān)產(chǎn)蛋白類抗真菌物質(zhì)的乳酸菌的報(bào)道不多，報(bào)道的乳酸菌有以下幾種：乳酸乳球菌乳酸亞種(Lc.lactis subsp.lactis)[11]、干酪乳桿菌假植物亞種(Lb.casei subsp.pseudoplantarum)[12]、小球片球菌(P. pentosaceous)[13]、副干酪乳桿菌(L. paracasei)[14]等．關(guān)于植物乳桿菌的也有報(bào)道，Str?m 等[15]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌MiLAB393能產(chǎn)生抗真菌的環(huán)二肽．

2.3.3 溫度對抗真菌活性物質(zhì)的影響

溫度對抗真菌活性物質(zhì)抑菌活性的影響見表 3．由表3可知，植物乳桿菌IMAU10014發(fā)酵后的濃縮上清液分別于 60,℃加熱 1,h、80,℃加熱 1,h、100,℃加熱 1,h、121,℃加熱 20,min，抑菌圈大小基本不變.這說明發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)有很好的熱穩(wěn)定性．

表3 溫度對抑菌活性的影響Tab.3 Influence of temperature on the antifungal activity

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)以MRS為培養(yǎng)基從60株植物乳桿菌中篩出8株抑菌活性較好的菌株，又以大豆蛋白和脫脂奶粉為培養(yǎng)基從 8株植物乳桿菌中進(jìn)一步篩選出 1株具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株 IMAU10014，并確定了其發(fā)酵培養(yǎng)基為大豆蛋白．對植物乳桿菌 IMAU10014的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基組合及培養(yǎng)條件：葡萄糖 20,g/L、大豆蛋白5,g/L、pH 6.5、溫度 37,℃植物乳桿菌 IMAU10014發(fā)酵 48,h時(shí)抑菌效果最佳．分別檢測了不同 pH、溫度及酶處理對 IMAU10014發(fā)酵濃縮上清液的抑菌活性的影響，結(jié)果表明：濃縮上清液在 pH 3.5～7.0范圍內(nèi)均有抑菌活性，且隨著 pH的升高抑菌活性逐漸降低．抑菌物質(zhì)對溫度不敏感．經(jīng)過胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌活性有所降低．

［1］ 成妮妮. 乳酸菌抗真菌生物防腐劑作用機(jī)理和前景展望[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33(4)：430-433.

［2］ 袁晶. 植物乳桿菌作用及其應(yīng)用初探[D]. 杭州：浙江工商大學(xué)，2011.

［3］ Crowley S，Mahony J，van Sinderen D. Comparative analysis of two antifungal Lactobacillus plantarum isolates and their application as bioprotectants in refrigerated foods[J]. Journal of Applied Microbiology，2012，113(6)：1417-1427.

［4］ Gerez C L，Torino M I，Rollán G，et al. Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties[J]. Food Control，2009，20(2)：144-148.

［5］ Yang E J，Chang H C. Purification of a new antifungal compound produced by Lactobacillus plantarum AF1 isolated from kimchi[J]. International Journal of Food Microbiology，2010，139(1/2)：56-63.

［6］ 于志會(huì)，張雪，李盛鈺，等. 植物乳桿菌 C88在酸奶中的應(yīng)用[J]. 中國乳品工業(yè)，2013，41(7)：27-30.

［7］ Rekha C R，Vijayalakshmi G. Bioconversion of isoflavone glycosides to aglycones ，mineral bioavailability and vitamin B complex in fermented soymilk by probiotic bacteria and yeast[J]. Journal of Applied Microbiology，2010，109(4)：1198-1208.

［8］ Dalié D K D，Deschamps A M，Richard-Forget F. Lactic acid bacteria-potential for control of mould growth and mycotoxins：A review[J]. Food Control，2010，21(4)：370-380.

［9］ Batdorj B，Trinetta V，Dalgalarrondo M，et al. Isolation，taxonomic identification and hydrogen peroxide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis T31，isolated from Mongolian yoghurt：Inhibitory activity on foodborne pathogens[J]. Journal of Applied Microbiology，2007，103(3)：584-593.

［10］ 李紅娟，劉鷺，張書文，等. Lactobacillus casei AST18抗真菌特性及其在酸奶保鮮中的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(19)：4050-4057.

［11］ Roy U，Batish V K，Grover S，et al. Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28. 3[J]. International Journal of Food Microbiology，1996，32(1/2)：27-34.

［12］ Gourama H. Inhibition of growth and mycotoxin production of Penicillium by Lactobacillus species[J].LWT-Food Science and Technology，1997，30(3)：279-283.

［13］ Rouse S，Harnett D，Vaughan A，et al. Lactic acid bacteria with potential to eliminate fungal spoilage in foods[J]. Journal of Applied Microbiology ，2008 ，104(3)：915-923.

［14］ 樓秀玉，張晨，張小美，等. 抗煙曲霉乳酸菌菌株的篩選、鑒定及特性初步研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25(1)：176-181.

［15］ Str?m K，Sj?gren J，Broberg A，et al. Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro)and cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro)and 3-phenyllactic acid[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68(9)：4322-4327.