細胞松弛素D對大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞水通道蛋白和內(nèi)向整流性鉀通道4.1基因表達的影響①

杜文佳，汪玉良，黨躍修，雷栓虎，黃良增，汪靜，馬靖琳，安麗萍

細胞松弛素D對大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞水通道蛋白和內(nèi)向整流性鉀通道4.1基因表達的影響①

杜文佳，汪玉良，黨躍修，雷栓虎，黃良增，汪靜，馬靖琳，安麗萍

目的探討不同濃度細胞松弛素D(CytD)對大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞骨架重構(gòu)，水通道蛋白(AQP)1、AQP4及內(nèi)向整流性鉀通道4.1(Kir4.1)基因表達的影響。方法原代培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞，加CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.80 μg/ml和1.00 μg/ml共培養(yǎng)2 h、12 h和24 h。MTT法檢測細胞增殖情況；鬼筆環(huán)肽聯(lián)合Hoechst 33342套染后激光共聚焦顯微鏡下觀察共培養(yǎng)2 h后細胞骨架重構(gòu)情況；RT-PCR法檢測共培養(yǎng)2 h時AQP1、AQP4和Kir4.1 mRNA表達水平。結(jié)果細胞生存率隨CytD濃度升高和作用時間延長而減少。CytD使大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞微絲發(fā)生解聚、彎曲，但極性未失。CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml和0.40 μg/ml上調(diào)AQP1、AQP4和Kir4.1 mRNA表達。結(jié)論適當濃度CytD可以重建星形膠質(zhì)細胞骨架，上調(diào)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞AQP1、AQP4和Kir4.1基因表達。

星形膠質(zhì)細胞；細胞松弛素；細胞骨架；水通道蛋白；內(nèi)向整流性鉀通道；脊髓；大鼠

[本文著錄格式] 杜文佳，汪玉良，黨躍修，等.細胞松弛素D對大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞水通道蛋白和內(nèi)向整流性鉀通道4.1基因表達的影響基因表達的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2014,20(7):616-620.

星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有免疫調(diào)節(jié)、維持神經(jīng)元微環(huán)境相對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)突觸信號傳遞等作用[1-4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，膠質(zhì)細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)生水腫，導(dǎo)致細胞骨架重構(gòu)，進而影響細胞物質(zhì)運輸、基因表達和信號傳遞等生命過程。水通道蛋白(aquaporin,AQPs)是星形膠質(zhì)細胞中一組參與跨細胞水轉(zhuǎn)運的膜通道蛋白，它們不僅在維持顱內(nèi)滲透壓及水電解質(zhì)平衡中發(fā)揮著重要作用，同時也參與腦缺血、腦腫瘤和顱內(nèi)感染等誘發(fā)的腦水腫病理過程。本研究采用細胞松弛素D(cytochalasin D,CytD)對體外培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞重構(gòu)其細胞骨架系統(tǒng)，研究不同濃度CytD作用下，星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學、微絲系統(tǒng)的改變及AQP1、AQP4和內(nèi)向整流性鉀通道4.1(inward rectifying potassium channel 4.1,Kir4.1)基因表達的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級新生2～3 d Sprague-Dawley大鼠，由甘肅中醫(yī)學院動物實驗中心提供(動物質(zhì)量合格證號：SCXK甘2004-0006-152)。

1.2 主要儀器與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和胰蛋白酶：GIBCO公司。青霉素、鏈霉素：華北制藥股份有限公司。阿糖胞苷：上海華聯(lián)制藥有限公司。CytD、多聚賴氨酸和Triton X-100：SIGMA公司。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)兔多克隆抗體：PROTEINTECH GROUP公司。羊抗兔IgG-FITC：北京中杉公司。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒：INVITROGEN公司。激光共聚焦顯微鏡：OLYMPUS公司。實時定量PCR儀：BIORAD公司。二氧化碳培養(yǎng)箱：SANYO公司。

1.3 星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)

新生Sprague-Dawley大鼠10只，75%酒精浸泡5 min后移至超凈工作臺，無菌條件下分離脊髓組織；DMEM培養(yǎng)液清洗1次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化15 min，完全培養(yǎng)液終止消化。反復(fù)吹打后，1500 r/min離心10 min，棄上清。200目篩網(wǎng)過濾后加入DMEM-F12培養(yǎng)基(含10%FBS)，加入完全培養(yǎng)基，重懸細胞，將其接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，差速貼壁。將細胞轉(zhuǎn)移至5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48 h后換液。以后每隔3 d換液1次，待細胞融合成單層并鋪滿瓶底后，傳代培養(yǎng)。

1.4 星形膠質(zhì)細胞的鑒定

取P2代細胞，以每孔3×103個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h。棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加預(yù)冷甲醛200 μl，37℃固定20 min；PBS清洗3次，加入PBS-T 200 μl，4℃10 min后移除PBS-T，PBS清洗5 min；加入PBS-B 200 μl，37℃30 min。加入GFAP一抗100 μl，4℃過夜，PBS清洗5 min；加羊抗兔FITC標記二抗150 μl，37℃ 1 h；PBS洗3次，每次5 min。封片，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，熒光顯微鏡下檢測GFAP表達并拍照。

1.5 MTT檢測

P2代星形膠質(zhì)細胞以3×103/ml接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，分別換入含CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.80 μg/ml、1.00 μg/ml完全培養(yǎng)液，空白對照組正常換液。培養(yǎng)2 h、12 h和24 h后棄去上清液，每孔加入無血清DMEM/ F12培養(yǎng)液100μl、0.5%MTT 10μl、DMSO 100μl，振蕩10 min，酶標儀570 nm波長檢測吸光度(OD)。

1.6 激光共聚焦顯微觀察

P2代星形膠質(zhì)細胞以每孔5×105接種于24孔板內(nèi)進行細胞爬片，分別換含CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.8 μg/ml的完全培養(yǎng)基，空白對照孔正常換液。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，每孔加入4%多聚甲醛1 ml，室溫固定20 min。10 μg/ml鬼筆環(huán)肽37℃染色1 h，PBS洗3次，每次5 min；加入10 μg/ml Hoechst 33342室溫染色15 min，PBS洗3次?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄怪孟嗖铒@微鏡下觀察細胞形態(tài)，激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 RT-PCR

按照Trizol說明書提取空白對照組以及各濃度CytD培養(yǎng)2 h后星形膠質(zhì)細胞總RNA，A260、A280檢測提取純度及濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取1 μg總RNA為模板，以寡核苷酸(Oligo dT)為引物，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，所得cDNA-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，用RT-PCR試劑盒進行擴增與定量反應(yīng)，引物序列見表1，反應(yīng)體系50 μl，擴增條件為50℃ 2 min，95℃預(yù)變性2 min后，95℃ 15 s、61.2℃ 35 s，共45個循環(huán)，每次延伸結(jié)束后讀板，采用2-ΔΔCt法對基因表達進行定量分析，所有實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列表

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)及鑒定

P2細胞GFAP陽性率＞95%。倒置相差顯微鏡觀察：GFAP陽性細胞胞體較大，有短而粗大的突起，形態(tài)不規(guī)則，輪廓較清晰(圖1)。

2.2 MTT

培養(yǎng)2 h后，與空白對照組比較，CytD各濃度組細胞的存活率均有所下降，且0.80 μg/ml和1.00 μg/ml組有顯著性差異(P＜0.05)；培養(yǎng)12 h、24 h后，CytD各濃度組細胞存活率進一步下降，與空白對照組均存在顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.3 細胞骨架

倒置相差顯微鏡下觀察，空白對照組細胞胞體較大，呈星形或多角形，胞突較多較長，胞核圓形或橢圓形，常偏于胞體一側(cè)。CytD各濃度組細胞體積增大，形狀不規(guī)則，胞突數(shù)量增多，細胞間緊密連接變少，胞核區(qū)域不明顯。見圖2。

激光共聚焦顯微觀察，空白對照組細胞微絲骨架排布呈明顯極性，分布均勻，微絲筆直；Cyt D可使星形膠質(zhì)細胞微絲骨架發(fā)生解聚并彎曲，呈片狀，但未喪失排布極性。見圖3。

2.4 RT-PCR

與空白對照組比較，Cyt D 0.05 μg/ml、0.10 μg/ ml、0.20 μg/ml和0.40 μg/ml濃度組AQP1表達量上調(diào)(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)；AQP4表達上調(diào)(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)；Kir4.1表達上調(diào)(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

表2 各組細胞生存率比較

表3 各組細胞AQP1、AQP4和Kir4.1表達比較

圖1 細胞培養(yǎng)與鑒定(100×)

圖2 各組細胞培養(yǎng)2 h形態(tài)(倒置相差顯微鏡，400×)

圖3 各組細胞培養(yǎng)2 h形態(tài)(激光共聚焦顯微鏡，400×)

3 討論

細胞骨架是真核細胞中的蛋白網(wǎng)架系統(tǒng)[7]。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質(zhì)骨架、細胞膜骨架和細胞外基質(zhì)，形成貫穿于細胞核和細胞質(zhì)的網(wǎng)架體系[8]；通常所稱的狹義細胞骨架是指細胞質(zhì)骨架，由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成[9]。細胞骨架能維持細胞的正常形態(tài)，但并非靜止的支架系統(tǒng)，而是一個組裝與去組裝動態(tài)平衡的網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)揮著多種生物學功能[10]。

CytD是公認的能夠破壞細胞微絲的藥物[11]。我們采用CytD對大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的微絲系統(tǒng)進行干預(yù)。我們的研究證實，CytD對星形膠質(zhì)細胞體外增殖有一定抑制作用，但0.05～0.40 μg/ml濃度共培養(yǎng)2 h，細胞生存率＞90%，與空白對照組無顯著性差異。

相差顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察，CytD可使星形膠質(zhì)細胞體積增大，偽足增長，胞突數(shù)量增多，細胞間緊密連接喪失；細胞骨架解聚。已有研究報道，星形膠質(zhì)細胞緊密連接的破壞，可能與臨床腦外傷后血腦屏障破壞產(chǎn)生廣泛的腦水腫有關(guān)[12]。我們推測，星形膠質(zhì)細胞水腫可能與細胞骨架解聚存在著一定關(guān)系。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布著幾種AQPs，其中研究較多的有AQP1、AQP4和AQP9。有研究顯示，AQP1和AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的AQPs，與腦脊液的形成存在密切聯(lián)系；由于分布位置的特殊性，AQP4在腦水腫顱內(nèi)水平衡調(diào)節(jié)上可能發(fā)揮著重要作用[13-15]。

AQP1和AQP4與脊髓損傷后水腫的形成也關(guān)系密切。有研究表明，星形膠質(zhì)細胞膜上AQP4和Kir4.1在某些膠質(zhì)細胞特殊膜域有密切的共同表達，推測AQP4介導(dǎo)的水分子轉(zhuǎn)運可能與Kir4.1調(diào)節(jié)K+跨膜轉(zhuǎn)運作用相偶聯(lián)[16-17]。關(guān)于細胞骨架與膜蛋白之間的關(guān)系，目前研究較多的是細胞骨架與心肌快鈉內(nèi)流(INa)的關(guān)系。已有研究表明，細胞骨架的重構(gòu)與心肌細胞膜蛋白功能存在密切聯(lián)系[18]。星形膠質(zhì)細胞與細胞骨架之間的關(guān)系鮮有報道。

本研究中RT-PCR結(jié)果顯示，CytD可以上調(diào)AQP1、AQP 4和Kir4.1 mRNA的表達水平，推測星形膠質(zhì)細胞骨架對與水腫相關(guān)的離子通道及膜蛋白具有調(diào)節(jié)作用，細胞骨架解聚可能導(dǎo)致細胞水腫發(fā)生。

本文通過CytD重構(gòu)星形膠質(zhì)細胞的細胞骨架，應(yīng)用形態(tài)學及RT-PCR等方法檢測星形膠質(zhì)細胞水通道蛋白以及K+通道基因表達水平。結(jié)果提示，應(yīng)用CytD后，星形膠質(zhì)細胞骨架發(fā)生解聚，AQPs、Kir4.1表達水平上調(diào)；不同濃度CytD對AQPs、Kir4.1表達的調(diào)控可在2 h內(nèi)實現(xiàn)，并存在量效關(guān)系。我們推測，微絲解聚可能會引起細胞水腫，其機制可能與上調(diào)水腫相關(guān)基因表達有關(guān)。這些為臨床治療脊髓損傷、脊髓水腫提供了基礎(chǔ)實驗資料。

為了進一步研究細胞骨架解聚與細胞水腫的關(guān)系，還需進一步進行體內(nèi)實驗。

[1]Nag S.Morphology and properties of astrocytes[J].Methods Mol Biol,2011,686:69-100.

[2]Figley CR,Stroman PW.The role(s)of astrocytes and astrocyte activity in neurometabolism,neurovascular coupling,and the production of functional neuroimaging signals[J].Eur J Neurosci,2011,33(4):577-588.

[3]Barker AJ,Ullian EM.Astrocytes and synaptic plasticity[J]. Neuroscientist,2010,16(1):40-50.

[4]魏開斌,卓鋒,劉紅,等.靜脈移植人臍帶間充質(zhì)干細胞治療急性脊髓損傷[J].中華實驗外科雜志,2012,29(12):2579.

[5]Wang F,Feng XC,Li YM,et al.Aquaporins as potential drug targets[J].Acta harmacol Sin,2006,27(4):395-401.

[6]Janmey PA.The cytoskeleton and cell signaling:componentlocalization and mechanical coupling[J].Physiol Rev,1998,78 (3):763-781.

[7]Ochi M.Clinical results of transplantation of tissue-engineered cartilage and future direction of cartilage rep air-novel approach with minimally invasive procedure[J].Yonsei Med J, 2004,45(12):45-74.

[8]Redman SN,Oldfield SF,Archer CW,et al.Current strategies for articular cartilage repair[J].Eur Cell Mater,2005,14(9): 23-32.

[9]Buckwalter JA,Mow VC,Ratliff A.Restoration of injured or degenerated articular surfaces[J].J Am Acad Orthop Surg, 1994,2(4):192-201.

[10]Iwata H.Pharmacologic and clinical aspects of intra articular injection of hyaluronate[J].Clin Orthop Relat Res,1993,289 (4):285-291.

[11]王彥明,余家闊,于長隆,等.Pridie鉆孔術(shù)修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的臨床療效觀察[J].中國微創(chuàng)外科雜志,2006,6(11): 8612-8631.

[12]王克萬,漆松濤,楊志煥,等.培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞牽張損傷后超微結(jié)構(gòu)的變化[J].第一軍醫(yī)大學學報,2002,22(8): 687-696.

[13]McConnell NA,Yunus RS,Gross SA,et al.Water permeability of an ovarian antral follicle is predominantly transcellular and mediated by aquaporins[J].Endocrinology,2002,143(8): 2905-2912.

[14]Gohara T,Ishida K,Nakakimura K,et al.Temporal profiles of aquaporin 4 expression and astrocyte response in the process of brain damage in fat embolism model in rats[J].J Anesth,2010, 24(2):225-233.

[15]Zeng HK,Wang QS,Deng YY,et al.Hypertonic saline ameliorates cerebral edema through downregulation of aquaporin-4 expression in the astrocytes[J].Neuroscience,2010,166(3): 878-885.

[16]Nagelhus EA,Horio Y,Inanobe A,et al.Irnrnunogold evidence suggests that coupling of K+siphoning and water transport in rat retinal Muller cells is mediated by a coenrichment of Kir4.1 and AQP4 in specific membrane domains[J].Glia, 1999,26(1):47-54.

[17]Nagelhus EA,Mathilsen TM,Ottersen OP.Aquaporin-4 in the central nervous system:cellular and subcellular distribution and coexpression with Kir4.1[J].Neuroseience,2004,129(4): 905-913.

[18]Berdiev BK,Prat AG,Cantiello HF,et al.Regulation of epithelial sodium channels by short actin filaments[J].Biol Chem,1997,271(30):17704-17710.

Effects of Cytochalasin D on Expression of Aquaporins and Inward Rectifying Potassium Channel 4.1 Gene in Spinal Cord Astrocytes of Rats

DU Wen-jia,WANG Yu-liang,DANG Yue-xiu,et al.Department of Orthopedics,The Second Hospital of Lanzhou University, Orthopaedics Key Laboratory of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China

ObjectiveTo investigate the expression of aquaporin(AQP)1,AQP4,inward rectifying potassium channel 4.1(Kir4.1)and cytoskeleton features of rat spinal cord astrocytes after cytochalasin D(CytD)intervention.MethodsSpinal cord astrocytes isolated from 2～3-day-old rats were cultured till confluency.MTT was used to assess survival rate of astrocytes 2 h,12 h and 24 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml,0.80 μg/ml and 1.00 μg/ml of CytD,respectively.Confocal microscopy was used to observe cytoskeleton features of astrocytes 2 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml of CytD.The expression of AQP1, AQP4,Kir4.1 mRNA were determined with real-time PCR 2 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml,0.80 μg/ml and 1.00 μg/ml of CytD.ResultsThe survival rate of rat spinal cord astrocytes reduced with the time of co-culture and concentration of CytD(P＜0.05).The cytoskeleton of astrocytes was reconstructed.The expression of AQP1,AQP4 and Kir4.1 mRNA increased after co-cultured with 0.05～0.40 μg/ml of CytD.ConclusionThe appropriate dosage of CytD may remodel the cytoskeleton and increase the mRNAexpression ofAQP1,AQP4 and Kir4.1 in spinal cord astrocytes of rats.

astrocyte;cytochalasin;cytoskeleton;aquaporin;inward rectifying potassium channel;spinal cord;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.07.003

R651.2

A

1006-9771(2014)07-0616-05

2013-10-22

2013-11-27)

1.甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃項目(No.1004TCYA028)；2.蘭州大學第二醫(yī)院2010年度院內(nèi)科研項目(No.YJ2010-48)。

1.蘭州大學第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)病重點實驗室，甘肅蘭州市730030。作者簡介：杜文佳(1980-)，男，甘肅山丹縣人，碩士研究生，主要研究方向：脊髓損傷與骨腫瘤。通訊作者：汪玉良，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。