云南漢族人群Tim－1基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關聯(lián)性研究

彭傳梅，高 輝，付曉野，曹向紅，董玉琳，王 楊

云南漢族人群Tim－1基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關聯(lián)性研究

彭傳梅，高 輝＊，付曉野，曹向紅，董玉琳，王 楊

（昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，云南昆明650051）

目的探討Tim－1啟動子區(qū)－416G＞C和－1454G＞A位點基因多態(tài)性與云南高原地區(qū)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的遺傳易感性有無關聯(lián)。方法采用PCR－RFLP方法對132名云南漢族SLE病人和120名健康體檢者Tim－1啟動子區(qū)多態(tài)性位點－416G＞C和－1454G＞A的基因多態(tài)性進行檢測，同時采用間接免疫熒光法檢測其抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體三種自身抗體。結果SLE組和對照組Tim－1啟動子區(qū)多態(tài)性位點－416G＞C的基因型及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而－1454G＞A位點的基因型及等位基因頻率在SLE組與對照組中的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SLE組和對照組三種SLE相關自身抗體檢測陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SLE組兩個位點不同基因型中三種自身抗體檢測陽性率的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論云南漢族人群Tim－1啟動子區(qū)－416G＞C和－1454G＞A位點存在單核苷酸多態(tài)性變異，且－1454G＞A位點多態(tài)性變異與SLE遺傳易感性相關，但兩位點不同基因型不會影響SLE相關自身抗體的表達。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡、T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白－1、基因多態(tài)性、遺傳易感性

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1961）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種發(fā)病緩慢，臨床表現(xiàn)多樣、涉及機體許多系統(tǒng)和臟器的自身免疫性疾病，其發(fā)病率在種族、地區(qū)上差別很大：有色人種比白種人發(fā)病率高，我國患病率遠遠高于西方國家。SLE的病因和發(fā)病機制尚未完全清楚，一般認為：遺傳、環(huán)境等為其發(fā)病主要誘因。T細胞在SLE的發(fā)病過程中扮演重要角色，在其發(fā)病的不同環(huán)節(jié)均存在Th1／Th2細胞的不平衡性［1］。

T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，Tim）基因家族是McIntire等于2001年通過定位克隆技術發(fā)現(xiàn)的一個新的基因家族。小鼠Tim家族基因共有8個成員（Tim1－8），人Tim家族基因與小鼠有高度的同源性，在人類Tim家族發(fā)現(xiàn)只有3個基因分別為Tim－1，Tim－3和Tim－4，無Tim－2，定位于染色體5q33.2區(qū)域［2］。Tim－1基因是Tim基因家族第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，許多研究［3］表明Tim－1是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在自身免疫病、過敏性疾病等Th1／Th2相關性疾病中發(fā)揮重要作用，但在SLE中的作用研究尚處于起步階段。

近年來，國內(nèi)外的研究顯示人類Tim－1的啟動子區(qū)和編碼區(qū)均存在多態(tài)性的變化，這些多態(tài)性變化可能與哮喘、過敏性鼻炎和類風濕關節(jié)炎等疾病的易感性相關［4－6］。Tim家族基因是否參與SLE的發(fā)生發(fā)展目前少有報道。云南地處高原、紫外線輻射較強，為SLE高發(fā)地區(qū)，我們對云南高原地區(qū)漢族人群Tim－1啟動子區(qū)多態(tài)性位點－416G＞C和－1454G＞A的多態(tài)性與SLE以及與SLE相關自身抗體的關聯(lián)進行研究，為探索SLE易感的遺傳因素提供數(shù)據(jù)支持，為揭示SLE發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象SLE患者132例，其中男性16例，女性116例，年齡在18－78歲之間。SLE患者符合2009年美國風濕病協(xié)會修訂的SLE分類診斷標準。對照組為120名云南地區(qū)健康體檢者，其中男性27例，女性93例，年齡在22－67歲之間，無自身免疫性疾病相關病史。所有對象均為三代以內(nèi)居住在云南本地漢族居民，所有對象均無血緣關系。

1.2 在知情同意的原則下，采集SLE患者及健康體檢者EDTA抗凝靜脈血2ml。

1.3自身抗體檢測SLE組及對照組均采用熒光免疫印跡試劑盒（Omon，Germany）檢測三種自身抗體：抗雙鏈DNA抗體（dsDNA）、抗Sm抗體、抗RNP抗體。

1.4模板DNA提取采用人全血基因組DNA提取試劑盒（Axygen，USA）提取SLE患者及健康體檢者外周血基因組DNA，方法嚴格按照試劑盒的說明書進行，提取產(chǎn)物溶于TE緩沖液，－20℃保存。

1.5多態(tài)性位點的選擇及引物設計根據(jù)文獻選擇Tim－1的兩個多態(tài)性位點：－416G＞C和－1454G＞A，每個多態(tài)性位點的詳細資料見表1。參照GenBank中Tim－1DNA序列（編號AC026777）利用Primer Premier 5.0軟件自行設計并核實針對每個位點的PCR擴增引物，引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列及PCR條件見表1。

表1 Tim－1啟動子區(qū)多態(tài)性位點的引物設計

1.6PCR反應PCR反應體系總體積25μl：包括基因組DNA100ng，10×PCR緩沖液2.5μl，2.0 mmol／LMg2＋、dNTPs各10nmol，引物P1和P2各15pmol，TaqDNA聚合酶1U（Omega，USA），不足體積用滅菌雙蒸水補充至25μl。PCR反應循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5min，94℃40s，58－65℃40s，72℃60s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.7酶切、瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶（－416G＞C用TaqⅠ，－1454G＞A用MspⅠ）（Omega，USA）酶切：PCR產(chǎn)物5μl，10×酶切緩沖液1μl，限制性內(nèi)切酶2U，滅菌雙蒸水3.9μl，混勻，TaqⅠ酶切條件為65℃酶切2h；MspⅠ酶切條件為37℃酶切5h。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳、EB染色，觀察條帶。根據(jù)電泳圖確定基因型。

1.8測序選取部分代表不同基因型的擴增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序，驗證電泳結果。

1.9統(tǒng)計學分析應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用直接計數(shù)法計算基因型和等位基因頻率，進行Hardy－Weinberg平衡檢驗（P＞0.05），基因型和等位基因的組間比較、各自身抗體和基因型的相關性比較均采用χ2檢驗，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Tim－1啟動子區(qū)－416G＞C位點多態(tài)性采用PCR－RFCP分析PCR擴增產(chǎn)物879bp。酶切產(chǎn)物獲得3種基因型：①純合子GG基因型：有488bp、391bp 2個片段；②雜合子GC基因型：可見879bp、488bp和391bp 3個片段；③純合子CC基因型：只有879bp 1個片段。（圖1）

2.2基因型測序分析圖Tim－1啟動子區(qū)－416G＞C位點CC、GC、GG基因型測序分析圖。（圖2）。

2.3Tim－1啟動子區(qū)－1454G＞A位點多態(tài)性采用PCR－RFCP分析PCR擴增產(chǎn)物為515bp。酶切產(chǎn)物獲得3種基因型：①純合子GG基因型：有399 bp、116bp 2個片段；②雜合子GA基因型：可見515 bp、399bp和116bp 3個片段；③純合子AA基因型：只有515bp 1個片段。（圖3）

圖1 －416G＞C位點PCR及酶切產(chǎn)物電泳圖

圖2 －416G／C位點CC、GC、GG基因型測序分析圖

圖3 －1454G＞A位點PCR及酶切產(chǎn)物電泳圖

2.4基因型測序分析圖Tim－1啟動子區(qū)－1454G＞A位點GG、GA、AA基因型測序分析圖。（圖4）

2.5基因型與等位基因頻率分布根據(jù)酶切電泳結果，采用直接計數(shù)法統(tǒng)計基因型，計算等位基因頻率。－416G＞C位點和－1454G＞A位點基因型頻數(shù)分布符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律（P＞0.05），達到遺傳平衡，具有群體代表性（表2）。χ2檢驗結果顯示：SLE組與健康對照組－416G＞C位點基因型和等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而－1454G＞A位點基因型和等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

圖4 －1454G＞A位點GG、GA、AA基因型測序分析圖

表2 Tim－1基因兩位點基因型頻數(shù)分布的Hardy－Weinberg平衡檢驗

表3 Tim－1基因兩位點基因型頻率及等位基因頻率

2.6三種SLE相關自身抗體（抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體）檢測結果SLE組三種自身抗體檢測陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SLE組各基因型三種自身抗體檢測結果：見表4。經(jīng)χ2檢驗，SLE組中抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體檢測陽性率與Tim－1基因啟動子－416G＞C位點和－1454G＞A位點基因分型均無相關性（P＞0.05）。

表4 SLE組兩位點各基因型中三種自身抗體檢測結果

3 討論

人類基因組單核苷酸多態(tài)性（SNPs）是基因組變異中最常見的一種形式，在人類基因組中大概每1000個堿基就有1個SNP。不同人群之所以對疾病的易感程度有所區(qū)別、同種疾病的臨床表型不同以及對藥物會產(chǎn)生不同反應，部分受到SNP的影響。SNP作為第3代遺傳標記，在復雜疾病的基因定位、關聯(lián)分析、個體疾病易感性分析、同種疾病臨床表型分析以及藥物基因組學的研究中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。這種多態(tài)性在不同種族群體具有差異性。許多研究［7］均表明Tim基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病和過敏性疾病的易感性、臨床表型有著密切的關系，且不同種族、不同地區(qū)之間由于遺傳特征不同導致多態(tài)性變異亦不同［8－10］，但Tim基因的多態(tài)性與SLE的關聯(lián)研究尚處于起步階段。

本研究通過PCR－RFLP技術對云南高原地區(qū)漢族人群中132名SLE患者和120名健康者的Tim－1啟動子區(qū)多態(tài)性位點－416G＞C和－1454G＞A的多態(tài)性進行分析。SLE組與對照組－416G＞C和－1454G＞A位點的基因型分布均符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗，達到遺傳平衡，具有群體代表性。－416G＞C位點兩組間基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義，－1454G＞A位點兩組間基因型及等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義，表明云南漢族人群Tim－1啟動子區(qū)多態(tài)性位點－1454G＞A的多態(tài)性與SLE的遺傳易感性相關。對SLE高度相關三種自身抗體（抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體）進行分析，SLE組三種自身抗體檢測陽性率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。另外，SLE組中三種自身抗體陽性率與Tim－1基因啟動子區(qū)－416G＞C和－1454G＞A位點基因分型均無明顯相關性，說明Tim－1基因－416G＞C和－1454G＞A位點不同基因型不會影響SLE相關自身抗體的表達。

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Association Analysis of Tim－1 Polymorphism With Systemic Lupus Erythematosus in a Han Population of Yunnan Province

PEN Chuan－mei，GAO Hui，F(xiàn)U Xiao－ye，et al.（Department of Medical Laboratory，The Affiliated Yanan Hospital of Kunming Medical University，Yunnan Kunming650051，China）

ObjectiveThe aim of the present study was to analyze the association between the polymorphic sites－416G＞C and－1454G＞A of Tim－1gene and susceptibility to systemic lupus erythematosus（SLE）in a group of Han population from Yunnan province.MethodsPolymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism analysis（PCR－RFLP）was used to detect the polymorphisms of－416G＞C and－1454G＞A sites in 132SLE patients and 120 controls，and we used indirect immunofluorescence assay to detect three related aotuantibodies of SLE，which includethe anti－double stranded DNA（dsDNA）antibody，the anti－Sm antibody and the anti－RNP antibody.ResultsWe found no statistical differences in genotype and allele frequency of－416G＞C between SLE and control group（P＞0.05），but there are statistically significant differences in genotype and allele frequency of－1454G＞A between SLE and control group（P＜0.05）；The positive rate of three autoantibodies between SLE and control group has statistically significant difference（P＜0.05），but the positive rate of three autoantibodies between different genotypes of－416G＞C and－1454G＞A in SLE group had no significant differences（P＞0.05）.ConclusionThe－416G＞C and－1454G＞A sites of Tim－1gene have SNP variations，and the polymorphic variation of－1454G＞A site is related to the susceptibility to SLE in a Han population of Yunnan province，but different genotypes of these two sites don，taffect the expression of related autoantibodies of SLE.

SLE；Tim－1；gene polymorphism；susceptibility

彭傳梅，女，34歲，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向為自身免疫性疾病發(fā)病機理。

2014－05－08）

1007－4287（2014）12－1961－05

云南省科技廳－昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項項目（2011FB232）

＊通訊作者

：R593.24

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