白藜蘆醇通過誘導(dǎo)自噬保護(hù)糖尿病腎病大鼠腎功能的研究

李春花，張 英，李可心，周 磊

白藜蘆醇通過誘導(dǎo)自噬保護(hù)糖尿病腎病大鼠腎功能的研究

李春花1，張 英1，李可心1，周 磊2＊

（1.吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林長春130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科）

目的建立大鼠糖尿病腎病模型，探討白藜蘆醇其腎功能保護(hù)的機(jī)制。方法建立大鼠糖尿病腎病模型，生化分析法檢測血糖，酶聯(lián)免疫法測定24小時(shí)尿白蛋白排泄率，肌酐清除率，Western blot法檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3－II和Beclin1水平變化。結(jié)果白藜蘆醇治療對糖尿病腎病大鼠血糖無明顯影響（P＞0.05），但可明顯降低糖尿病腎病大鼠肌酐清除率和24h尿白蛋白量（P＜0.05），提高LC3－II和Beclin1蛋白表達(dá)。結(jié)論白藜蘆醇可通過活化自噬功能發(fā)揮對糖尿病大鼠腎臟功能的保護(hù)作用。

糖尿病腎??；自噬；白藜蘆醇

Key words：diabetic nephropathy；autophagy；Resveratrol

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1920）

在糖尿病的血管并發(fā)癥中，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是終末期腎病（end－stage renal disease）的主要原因，也是心血管疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素［1］。然而，在臨床治療中，血糖穩(wěn)態(tài)控制的困難及RAS抑制劑治療難以完全阻斷腎病進(jìn)展，都迫切需要對DN發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究，促進(jìn)新的DN治療策略的發(fā)展。國內(nèi)外已有大量研究證明，白藜蘆醇對糖尿病的多種并發(fā)癥具有良好的治療作用，但機(jī)制尚不完全清楚［2］。SIRT1作為三級組蛋白去乙酰化酶，其活性變化可影響線粒體代謝和功能［3］。自噬是高度保守的，并受嚴(yán)密調(diào)控的，參與長壽命蛋白和受損細(xì)胞器降解的過程，作為是線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一發(fā)揮重要的保護(hù)機(jī)制［4］。本研究建立糖尿病腎病大鼠動物模型，觀察給予白藜蘆醇干預(yù)后大鼠腎組織中自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)變化，探討其對腎臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物健康雄性Wistar大鼠45只，體重（200 ±20）g。隨機(jī)對照組（C組）15只，糖尿病腎病組（DN組）15只，白藜蘆醇治療組（RSV組）15只。

1.2方法

1.2.1 試劑與儀器 白藜蘆醇（購自美國Sigma公司），一抗二抗（購自美國Santa cruz公司，全自動生化分析儀（日本Olympus公司）。

1.2.2 建立糖尿病腎病大鼠模型 參考文獻(xiàn)進(jìn)行少量修改，建立2型DN大鼠模型。健康Wistar大鼠，高脂飲食，腹腔一次性注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）50mg／kg建立2型糖尿病模型，（空腹血糖≥16.7mmol／L，尿糖＋＋以上），繼續(xù)喂養(yǎng)12周，根據(jù)血尿生化學(xué)檢測、組織形態(tài)學(xué)檢測，確立糖尿病腎病大鼠模型建立成功。

1.2.3 給藥方法 C組正常大鼠生理鹽水5ml／kg／d灌胃。糖尿病腎病大鼠造模成功后，DN組生理鹽水5ml／kg／d灌胃，RSV組白藜蘆醇20mg／kg／d灌胃。所有動物均連續(xù)給藥12周，于治療結(jié)束后，收集24小時(shí)尿標(biāo)本，腹腔麻醉，取血標(biāo)本和腎組織標(biāo)本。

1.2.4 檢測指標(biāo) 全自動生化分析儀檢測肌酐清除率、尿蛋白濃度。尿蛋白定量計(jì)算公式：24h尿蛋白定量（mg／d）＝尿蛋白濃度（mg／L）×24h尿量（L）

1.2.5 腎組織形態(tài)學(xué)檢測 組織10%中性福爾馬林固定24h，常規(guī)石蠟包埋，HE染色鏡下觀察。

1.2.6 自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)變化 提取大鼠腎組織蛋白。Western blot法檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3－II和Beclin1表達(dá)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS16.0軟件分析。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1白藜蘆醇對DN大鼠肌酐清除率和24 h尿白蛋白的影響

各組大鼠肌酐清除率結(jié)果顯示，與C組相比，DN組大鼠肌酐清除率達(dá)到糖尿病腎病模型標(biāo)準(zhǔn)要求。與DN組相比，白藜蘆醇治療可明顯降低糖尿病腎病大鼠肌酐清除率（P＜0.05）。24h尿白蛋白結(jié)果表明，與DN組相比，白藜蘆醇治療可明顯降低糖尿病腎病大鼠24h尿白蛋白量（P＜0.05）。（見表1）

表1 白藜蘆醇對DN大鼠肌酐清除率和24 h尿白蛋白的影響（x—±s，n＝15）

2.2白藜蘆醇對糖尿病腎病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)影響

HE染色結(jié)果顯示，與C組相比，DN組大鼠腎小球毛細(xì)血管充血，系膜區(qū)增厚，系膜基質(zhì)增多，足突細(xì)胞肥大。白藜蘆醇組大鼠腎組織炎癥較輕，腎小球管型少見，腎小球充血減少，系膜區(qū)增厚與系膜基質(zhì)增多與DN組相比明顯減輕。（見圖1）

2.3白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎臟組織中自噬標(biāo)志蛋白LC3－II和Beclin1的影響

Western blot結(jié)果顯示，與C組相比，自噬標(biāo)志蛋白Beclin1和LC3－II在DN組無明顯變化。與DN組相比，RSV組Beclin1和LC3－II明顯增高（見圖2）。

3 討論

圖1 白藜蘆醇對糖尿病腎病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)影響

圖2 白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎臟組織中自噬標(biāo)志蛋白LC3－II和Beclin1的影響

糖尿病（diabetes mellitus）是慢性代謝性疾病，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈持續(xù)增長勢頭。糖尿病患者長期的高血糖狀態(tài)是促進(jìn)血管病變和功能障礙的根本因素，引起多種糖尿病并發(fā)癥，是糖尿病患者主要的致殘致死原因。在臨床治療中，血糖穩(wěn)態(tài)控制的困難及RAS抑制劑治療難以完全阻斷腎病進(jìn)展，都迫切需要對DN發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究，促進(jìn)新的DN治療策略的發(fā)展。

白藜蘆醇是一種從植物中提取出的多酚醇類物質(zhì)，是SIRT1的天然激活劑。而SIRT1作為代謝相關(guān)疾病治療研究的熱點(diǎn)，其在腎臟活化可能成為新的治療靶點(diǎn)，以抵抗多種因素導(dǎo)致的腎臟疾病包括DN的發(fā)生發(fā)展［3］。我們基于糖尿病腎病大鼠動物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇可明顯降低糖尿病腎病大鼠肌酐清除率，降低24h尿白蛋白量。HE染色結(jié)果顯示，白藜蘆醇組大鼠腎組織炎癥較輕，腎小球管型少見，腎小球充血減少，系膜區(qū)增厚與系膜基質(zhì)增多與DN組相比明顯減輕，均表明白藜蘆醇具有明顯的腎臟保護(hù)作用。

自噬的異常變化參與代謝性相關(guān)疾病包括糖尿病和腎病的發(fā)病過程［5］。根據(jù)腎損傷模型實(shí)驗(yàn)，自噬系統(tǒng)在足細(xì)胞、腎小管細(xì)胞中非常重要。足細(xì)胞存在顯著的高水平的組成型自噬，在足細(xì)胞特異性缺失自噬相關(guān)蛋白Atg5的老年鼠易引起腎小球疾病，并伴有氧化和泛素化蛋白聚集、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白尿，最終導(dǎo)致足細(xì)胞損失和腎小球硬化癥［6］。小鼠Atg5缺失可表現(xiàn)出對藥物（嘌呤霉素和阿霉素）誘導(dǎo)的腎小球損傷敏感性增加［7］。糖尿病動物腎臟的自噬缺陷可使小管細(xì)胞在缺氧和ER stress時(shí)易損，導(dǎo)致DN進(jìn)展。因此，自噬活化可能成為晚期DN的治療選擇。我們在蛋白水平檢測了自噬標(biāo)志蛋白Beclin1和LC3－II的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在白藜蘆醇干預(yù)下糖尿病腎病大鼠腎組織中，Beclin1和LC3－II明顯增高，表明白藜蘆醇可有效活化自噬。

結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和現(xiàn)有文獻(xiàn)研究，白藜蘆醇可通過活化自噬發(fā)揮對糖尿病大鼠腎臟功能的保護(hù)作用

［1］侯振江，牟兆新，周秀艷，等.尿微量白蛋白在糖尿病和高血壓腎病早期診斷中的應(yīng)用［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（9）：1389.

［2］Kume S，Thomas MC，Koya D.Nutrient sensing，autophagy，and diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2012，61（1）：23.

［3］Kitada M，Kume S，Takeda－Watanabe A，et al.，Sirtuins and renal diseases：relationship with aging and diabetic nephropathy［J］.Clin Sci（Lond），2013，124（3）：153.

［4］Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al.Autophagy fights disease through cellular self－digestion［J］.Nature，2008，451（7182）：1069.

［5］Wang Y，Li YB，Yin JJ，et al.Autophagy regulates inflammation following oxidative injury in diabetes［J］.Autophagy，2013，9（3）：272.

［6］Kume S，Thomas MC，Koya D.Nutrient sensing，autophagy，and diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2012，61（1）：23.

［7］Hartleben B，G?del M，Meyer－Schwesinger C，et al.Autophagy influences glomerular disease susceptibility and maintains podocyte homeostasis in aging mice［J］.J Clin Invest，2010，120（4）：1084.

Resveratrol protects renal function through inducing autophagy in diabetic nephropathy rats

LI Chun－h(huán)ua，ZHANG Ying，LI Ke－xin，et al.（Department of Endocrinology，People's Hospital of Jilin Province，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the mechanism of renal protective effects of resveratrol on diabetic rats.MethodsEstablishing DN rat model by streptozotocin biochemical analysis of blood glucose，measured 24－h(huán)our urinary albumin excretion rate by enzyme－linked immunosorbent assay，creatinine clearance rate，RT－PCR was used to detect mitochondrial fission，fusion gene transcripts levels，mitochondrial membrane potential detection.ResultsResveratrol treatment had no significant effects on blood glucose in DN rats（P＞0.05），but significantly reduced creatinine clearance and 24hurinary albumin（P＜0.05），and increased Beclin1and LC3－II protein expression.ConclusionResveratrol plays a protective role on renal function in DN rats by affecting autophagy function.

R587.2

：A

李春花（1978－），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究；周磊（1978－），男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腎臟疾病病理研究。

2014－04－18）

1007－4287（2014）12－1920－03

吉林省科技廳資助項(xiàng)目（No.20140520009JH）

＊通訊作者