積雪草苷防治支架再狹窄的生化調(diào)節(jié)機制

侯士強+方明+陳莎莎+叢欣鵬+張大東+李新明

[摘要] 目的：探討積雪草苷能否作為生化調(diào)節(jié)劑，有效減輕內(nèi)皮細胞損傷，進一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生。方法：選取原代人主動脈平滑肌細胞和主動脈成纖維細胞各1株，每株細胞設空白對照組、雷帕霉素組（Rapa）、積雪草苷組（At）、積雪草苷+雷帕霉素組。利用qRT-PCR檢測平滑肌細胞和成纖維細胞TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長因子1），Smad7，I型膠原基因表達水平，通過ELISA檢測I型膠原蛋白表達量，計算積雪草苷和雷帕霉素兩藥相互作用指數(shù)（CDI）。另將16只中華小型豬隨機分為A，B 2組，前降支球囊大壓力預擴后，植入同型雷帕霉素支架1枚。術(shù)后A組予生理鹽水30 mL·d^-1靜脈注射；B組予積雪草苷30 mg·kg^-1·d^-1（生理鹽水稀釋至30 mL）靜注。術(shù)后7，14 d ELISA法檢測2組血漿vWF（血管性血友病因子）表達水平；術(shù)后28 d復查冠脈造影，取支架血管段組織切片及染色，計算血管面積、支架內(nèi)面積、管腔面積和新生內(nèi)膜面積。結(jié)果：與對照組相比，兩藥聯(lián)合組顯著上調(diào)平滑肌細胞和成纖維細胞Smad7基因，下調(diào)TGF-β1，顯著抑制I型膠原基因表達（P<0.01）；平滑肌細胞中，兩藥聯(lián)合組與Rapa組對I型膠原抑制無顯著性差異，CDI為0.83；成纖維細胞中，兩藥聯(lián)合組優(yōu)于Rapa 組，存在顯著性差異（P<0.05），CDI為0.77。小型豬術(shù)后7，14 d，B組血漿vWF水平均顯著低于A組（P<0.05）；術(shù)后28 d，2組血管面積和支架內(nèi)面積無統(tǒng)計學差異；B組管腔面積顯著大于A組（P<0.05），B組新生內(nèi)膜面積顯著小于A組（P<0.05）。結(jié)論：積雪草苷通過上調(diào)Smad7蛋白表達，抑制TGF-β1表達，顯著減少胞外基質(zhì)合成與分泌，進一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生，減輕內(nèi)皮細胞損傷，是雷帕霉素的有效生化調(diào)節(jié)劑。

[關(guān)鍵詞] 積雪草苷；雷帕霉素；Smad7；生化調(diào)節(jié)劑

[收稿日期] 2013-09-24

[基金項目] 上海市自然科學基金項目（11ZR1431800）；上海市浦東新區(qū)領(lǐng)先人才基金項目（PWR12010-03）

[通信作者] 李新明，博士生導師，E-mail：xinmingli6@yahoo.com.cn

[作者簡介] 侯士強，碩士研究生，E-mail：houshiqiang@hotmail.com

支架術(shù)后再狹窄和支架術(shù)后遲發(fā)性血栓是目前經(jīng)皮冠脈介入治療（PCI）的主要問題。胞外基質(zhì)（ECM）約占支架術(shù)后再狹窄成分的80%，主要為I型膠原蛋白、彈力蛋白及α-平滑肌肌動蛋白，TGF-β1是調(diào)節(jié)ECM分泌的關(guān)鍵因子[1-5]。藥物支架在抑制血管外膜成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化和抑制內(nèi)中膜平滑肌細胞增殖的同時，也有效抑制了內(nèi)皮細胞增殖和修復，導致亞急性、遲發(fā)性支架內(nèi)血栓形成[6-7]。臨床上一直試圖尋找一種既能“顯著抑制增殖”，又具有“內(nèi)皮友好”功能的支架涂層藥物，但效果不佳。積雪草苷是積雪草中提取的單一大分子化合物，在皮膚創(chuàng)傷治療中具有抗炎和抗氧化作用，抑制成纖維細胞及胞外基質(zhì)合成，防止瘢痕生成[8-10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，積雪草苷可誘導腫瘤細胞凋亡，并與長春新堿顯示協(xié)同作用[11]。鑒于以往研究經(jīng)驗，本研究決定在不摒棄抗增殖藥物同時，根據(jù)免疫抑制劑特性，引入腫瘤治療領(lǐng)域中的“生化調(diào)節(jié)劑”概念。希望通過雷帕霉素聯(lián)合積雪草苷，能夠減輕內(nèi)皮細胞損傷，進一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 原代人主動脈平滑肌細胞株及培養(yǎng)基（美國Sciencell公司）；原代人主動脈成纖維細胞株及培養(yǎng)基（美國Sciencell公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑（美國Invitoren公司）；定量PCR試劑（日本Takara公司）；積雪草苷（蘇州寶澤堂）；雷帕霉素（上海微創(chuàng)公司）；引物由上海英駿生物有限公司設計合成。普通級中華實驗用小型豬16只（華東師范大學閔行實驗動物中心），體重25～35 kg，雌雄不限，6～8月齡；2.5/3.0 mm×15 mm雷帕霉素支架（上海微創(chuàng)公司）。

1.2 細胞傳代培養(yǎng)和加藥 人主動脈成纖維和主動脈平滑肌細胞株各傳1代，分別使用ECM，F(xiàn)M，SM專用培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，待細胞均勻鋪滿瓶底后，用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化收集。將每株細胞按培養(yǎng)條件均分為對照組（Blank，加入溶劑二甲亞砜，DMSO），雷帕霉素組（Rapa，1×10^-9mol·L^-1），積雪草苷組（At，1×10^-5mol·L^-1），積雪草苷+雷帕霉素組（Combination，1×10^-5mol·L^-1+1×10^-9mol·L^-1），加藥后，培養(yǎng)48 h。收集上清，12 000 r·min^-1離心15 min后，吸取上清，-20 ℃保存，用于后續(xù)ELISA實驗。收集細胞，直接抽提RNA，用于后續(xù)qRT-PCR檢測。

1.3 RT-PCR檢測 -80 ℃冰箱中取出RNA，0.2 mL PCR管中配置逆轉(zhuǎn)錄反應混合溶液，預變性后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應體系。根據(jù)每基因進行3孔平行反應的量，在PCR 8聯(lián)管中配制反應體系。將PCR管置于PCR儀，95 ℃ 30 s；隨后40個循環(huán)：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s。儀器使用ABI Prism 7900。引物序列見表1。

1.4 ELISA檢測及CDI計算 -20 ℃冰箱中取出上清，室溫下解凍，ELISA標準孔設置濃度梯度，樣品組每個樣本設3個孔，每孔加10 μL樣品，孵育30 min棄去液體，洗板5次，然后加酶標抗體孵育30 min，棄去液體洗板5次，加顯色劑避光孵育15 min，加終止液，酶標儀測定A并計算出相應濃度。計算兩藥聯(lián)合作用指數(shù)（CDI），CDI=AB/（A×B），AB為兩藥聯(lián)用組與對照組吸光度比值，A或B是各藥物單獨用藥組與對照組吸光度比值。理論上當CDI<1時兩藥有協(xié)同作用。本研究設定：當CDI<0.85時存在協(xié)同作用，CDI<0.80時協(xié)同作用較強。endprint

1.5 動物分組及再狹窄模型制備 將16只中華小型豬隨機分為A，B 2組，每組8只。所有小型豬術(shù)前3 d，每日喂服阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg。術(shù)前予小型豬安定3 mg·kg^-1，氯胺酮10 mg·kg^-1肌注麻醉，必要時靜脈追加3%戊巴比妥鈉3～5 mL。常規(guī)消毒鋪巾，手術(shù)分離右側(cè)股動脈，直視下穿刺置鞘，并予肝素200 U·kg^-1；行左、右冠脈造影，選取前降支直徑約2.5～3.0 mm的較平直血管段，定量冠脈造影（QCA）軟件測量直徑；送入預擴張球囊，定位于前降支目標血管段，按球囊/血管直徑1.2∶1，以16個大氣壓8～10 s快速預擴張，并前后輕微拉動球囊，損傷血管內(nèi)中膜；送入雷帕霉素支架，完全覆蓋預擴張部位，按球囊/血管直徑1.2∶1，以14～16個大氣壓，過度擴張10～15 s釋放；退出支架球囊，重復冠脈造影，排除血管夾層和血栓，確保冠脈前向血流（TIMI）3級；結(jié)束手術(shù)，縫合股動脈及皮膚。術(shù)后每日仍予阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg喂服，術(shù)后A組予生理鹽水30 mL·d^-1靜脈注射；B組予積雪草苷30 mg·kg^-1·d^-1（生理鹽水稀釋至30 mL）靜注，直至28 d時動物處死。

1.6 ELISA法測定小型豬血漿vWF 術(shù)后7，14 d分別采集A，B 2組小型豬靜脈血，試管中加入0.109 mol·L^-1枸椽酸鈉抗凝液（與血液按體積1∶9混合），置于離心機3 000 r·min^-1離心10 min，收集上層血漿，放于-80 ℃ 冰箱保存；采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測定血漿vWF含量。

1.7 支架血管段組織切片及HE染色 支架術(shù)后28 d復查冠脈造影，處死小型豬，分離冠狀動脈支架段血管，以4%多聚甲醛加壓沖洗管腔并固定。參考Buijs R方法[12]，將標本依次經(jīng)70%，80%，90%乙醇脫水，100%甲基丙烯酸甲酯包埋，切片機20 μm連續(xù)切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色觀察。

1.8 統(tǒng)計學處理 SPSS 17.0軟件包統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用方差分析，如方差分析拒絕無效假設，則采用Bonferrni法進行2組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人主動脈平滑肌細胞和主動脈成纖維細胞RT-PCR檢測 與對照組相比，兩藥聯(lián)合組顯著上調(diào)人平滑肌細胞和成纖維細胞Smad7基因，下調(diào)TGF-β1，顯著抑制I型膠原基因表達（P<0.05）；平滑肌細胞中，兩藥聯(lián)合組抑制效果略優(yōu)于雷帕霉素組，但無顯著性差異；成纖維細胞中，兩藥聯(lián)合組抑制效果顯著優(yōu)于雷帕霉素組（P<0.05），見表2。

2.2 人主動脈平滑肌細胞和主動脈成纖維細胞ELISA檢測 平滑肌細胞中，兩藥聯(lián)合組Ⅰ型膠原蛋白表達量略低于雷帕霉素組，但無顯著性差異，CDI為0.83；成纖維細胞中，兩藥聯(lián)合組Ⅰ型膠原蛋白表達量顯著低于雷帕霉素組（P<0.05），CDI為0.77，見表3。

2.3 小型豬再狹窄模型制備及冠脈造影結(jié)果 A，B 2組16只小型豬均順利完成術(shù)前冠脈造影及支架植入，但A組有1例小型豬在術(shù)后股動脈縫合過程中，因線結(jié)脫落，最終失血性休克死亡，被排除實驗。術(shù)后28 d，15只小型豬均再次復查冠脈造影，并與術(shù)前造影圖像對比，觀察支架段血管變化，見圖1。2組均未見明顯支架再狹窄，但A組有3例小型豬，支架管腔邊緣模糊，冠脈血流較慢，血流TIMI 3-。

2.4 ELISA法檢測血漿vWF A組（n=7）術(shù)后第7，14天vWF抗原水平分別為（169.13±5.33）%，（148.82±4.37）%，B組（n=8）術(shù)后第7，14天vWF抗原水平分別為（131.26±4.42）%，（112.66±3.67）%。支架術(shù)后7，14 d時，B組vWF表達水平均顯著低于A組（P<0.05）。

2.5 病理學分析 術(shù)后28 d，A，B 2組支架血管段組織切片HE染色見圖2，支架段冠狀動脈的平均血管面積、支架內(nèi)面積、管腔面積和新生內(nèi)膜面積見表4。2組血管面積和支架內(nèi)面積無統(tǒng)計學差異；B組管腔面積顯著大于A組（P<0.05），B組新生內(nèi)膜面積顯著小于A組（P<0.05）。

3 討論

積雪草苷是積雪草中提取的三萜類單分子化合物，廣泛應用于皮膚燒傷外科。體外應用cDNA微控陣技術(shù)檢測積雪草苷對皮膚成纖維細胞的基因表達譜作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)54種功能基因在不同時間位點顯著上調(diào)，包括負責細胞增生和細胞外基質(zhì)合成的特定功能基因[13]。研究發(fā)現(xiàn)，積雪草苷可作用于成纖維細胞的細胞核，抑制細胞核分裂，減少細胞內(nèi)DNA合成，使核仁變小或缺失，細胞生長呈抑制狀態(tài)，抑制率隨用藥濃度增大而顯著增加，抑制率最高可達73%[14]。同時，積雪草苷還會引起成纖維細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松、內(nèi)容物減少，核蛋白體脫顆粒，顯著抑制膠原蛋白合成和分泌，并呈劑量依賴效應[15]。因此，積雪草苷具有阻斷成纖維細胞生長增殖，抑制其合成分泌膠原蛋白的作用。有學者通過研究皮膚瘢痕成纖維細胞發(fā)現(xiàn)，積雪草苷可以顯著上調(diào)Smad7的mRNA表達，增加Smad7蛋白合成及向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移，顯著抑制TGF-β1信號，減少Ⅰ型膠原蛋白分泌[10]。但積雪草苷對于血管損傷修復過程中的成纖維細胞和平滑肌細胞是否也存在同樣作用機制，目前缺乏相關(guān)研究。

PCI術(shù)后，血管外膜成纖維細胞會通過偽足向內(nèi)中膜遷移，并通過表型修飾，轉(zhuǎn)化為分泌性肌成纖維細胞；中膜平滑肌細胞會向內(nèi)膜遷移，并由收縮型轉(zhuǎn)化為分泌型[16]。表型修飾后的平滑肌細胞和成纖維細胞通過遷移、增殖，大量分泌膠原、蛋白多糖等胞外基質(zhì)（ECM），約占支架術(shù)后再狹窄成分的80%，I型膠原蛋白是其中主要成分，而TGF-β1則是上游調(diào)節(jié)I型膠原蛋白分泌的關(guān)鍵因子[1-5]。endprint

研究顯示，相對于雷帕霉素單一用藥組，兩藥聯(lián)合組無論在平滑肌細胞還是成纖維細胞中，均能顯著下調(diào)TGF-β1，進一步抑制I型膠原蛋白表達，雖然在平滑肌細胞中沒有達到統(tǒng)計學意義，但CDI 0.83仍提示有較明顯的協(xié)同作用。雷帕霉素主要針對雷帕霉素靶蛋白，通過PI3K/AKT通路抑制TGF-β1，但TGF-β1同時還受Smads蛋白信號通路調(diào)節(jié)，而積雪草苷則能通過顯著上調(diào)Smad7基因，抑制TGF-β1表達，因而具有協(xié)同作用，這一點在qRT-PCR實驗中也得到證實[10，17]。

血管性血友病因子（vWF）是一種具有黏附功能的大分子糖蛋白，內(nèi)皮細胞是vWF合成和貯存的主要場所，vWF升高常作為內(nèi)皮細胞凋亡和內(nèi)皮細胞功能障礙的標志因子[18]；支架術(shù)后24 h即可出現(xiàn)內(nèi)皮細胞再生，約2周時再生速度達到最大，至6周后內(nèi)皮修復逐漸減慢，趨于停止[19]。有研究顯示，支架再狹窄模型中，豬冠狀動脈1個月的改變類似于人類冠狀動脈6個月的改變[20]。因此，以28 d作為小型豬再狹窄模型的隨訪期。

在中華小型豬模型中，由于手術(shù)損傷大量內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)支架術(shù)后即刻vWF表達水平最高；此后，隨著雷帕霉素釋放濃度逐漸降低，vWF表達水平也隨之下降。但不管在術(shù)后7 d內(nèi)皮細胞再生高峰，還是術(shù)后14 d內(nèi)皮再生速度減緩，B組由于積雪草苷干預，vWF表達水平始終顯著低于A組，說明積雪草苷顯著減少雷帕霉素導致的內(nèi)皮細胞損傷，其機制可能與抗氧化作用有關(guān)[9]。

小型豬術(shù)后28 d復查冠脈造影，與支架術(shù)后即刻造影相比，2組冠脈支架植入處均未見明顯狹窄，但A組有3例小型豬支架管腔邊緣模糊，冠脈血流TIMI 3-。由于術(shù)前采用球囊大壓力預擴，來回牽拉，并且支架過度釋放，所以對于血管內(nèi)膜的損傷要遠遠大于正常PCI手術(shù)。A組小型豬邊緣模糊可能與內(nèi)中膜增生有關(guān)，而冠脈血流減慢則可能是由于內(nèi)皮細胞大量受損，炎性反應激活，抑制內(nèi)皮細胞對NO等相關(guān)因子釋放，導致血管收縮和舒張活動減弱所致。2組小型豬模型的血管面積和支架內(nèi)面積無統(tǒng)計學差異；但B組管腔面積顯著大于A組（P<0.05），B組新生內(nèi)膜面積顯著小于A組（P<0.05），說明積雪草苷在顯著減少內(nèi)皮細胞損傷同時，可以協(xié)同雷帕霉素進一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生，是雷帕霉素防止再狹窄過程中的有效生化調(diào)節(jié)劑。

本研究存在一定局限，小型豬冠狀動脈術(shù)前并無粥樣硬化，且動物實驗的樣本量較小，隨訪時間偏短，這些可能一定程度上影響統(tǒng)計學結(jié)果。在接下來的研究中，將擴大樣本量至30頭小型豬，延長隨訪時間至6～12個月，以進一步觀察積雪草苷在防治支架再狹窄過程中的生化調(diào)節(jié)作用。

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