袖珍菇多糖提取的研究

王蓓

（江蘇省揚(yáng)州商務(wù)高等職業(yè)學(xué)校，江蘇 揚(yáng)州 225127）

袖珍菇（P1eurotusgeesteranus Singer），別名小平菇，環(huán)柄側(cè)耳，隸屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬。它具有甜香的海鮮型氣味，其味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素和鐵、鈣等微量元素，且含有人體所必需的8種氨基酸，長期食用有降低高血壓和降低膽固醇的功能，是開發(fā)前景十分廣闊的珍貴食用菌。

食用菌具有多種功效因子和較高的藥用價值。歸納起來，食用菌中的多糖]主要有以下幾方面的保健功效[1]。

（1）增強(qiáng)機(jī)體免疫力；（2）抑制腫瘤作用；（3）降低膽固醇、降血壓和抗血栓作用；（4）抗疲勞、抗衰老作用；（5）抗病毒作用；（6）抗氧化作用。

食用菌多糖具有多方面的活性，特別是增強(qiáng)人體免疫力，且對正常細(xì)胞無毒害作用，因此隨著對食用菌多糖的研究的不斷加強(qiáng)，食用菌多糖必將在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的潛在發(fā)展空間和前景。本文以袖珍菇為原料進(jìn)行多糖技術(shù)提取研究。

1 材料和方法

1.1 原料與設(shè)備

1.1.1 原料

新鮮袖珍菇：市售。

1.1.2 試劑

乙醚（分析純）、氯仿、正丁醇（分析純）、無水乙醇（分析純）、60%的乙醇、70%的乙醇、80%的乙醇、濃硫酸（分析純）、苯酚（分析純）、葡萄糖（分析純）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070）：上海精密實(shí)驗設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26）：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52D）：上海青浦滬西儀器廠；循環(huán)水真空泵（SHZ-ⅢB）：上海儀表（集團(tuán)）供銷公司；磁力攪拌器（84-1A）：上海閔行虹浦儀器廠；離心機(jī)（centrifuge5804）：基因有限公司；電子天平AB54型：瑞士METTLER TOLEDO；高速萬能粉碎機(jī)（A11 basic）：廣州儀科公司；分光光度計：上海凌光技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

將市售的新鮮袖珍菇，置于烘箱內(nèi)40℃烘干，用粉碎機(jī)粉碎，存放在干燥容器備用。

1.2.2 袖珍菇多糖含量的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸-苯酚[2]法。糖在濃硫酸的作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，在波長490 nm處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖含量呈線性關(guān)系正比，從而可以利用分光光度計測定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品的多糖含量。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中，加水至刻度，吸取10 mL，再定容至50 mL，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mg/mL。分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg 以蒸餾水補(bǔ)至 2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL搖勻，室溫靜置10 min，于490 nm測吸光度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，用excel軟件求得回歸方程。

表1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度Table 1 The absorbency polysaccharide standard curve

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Polysaccharide standard curve

1.2.3 熱水浸提法提取袖珍菇多糖

1.2.3.1 工藝流程[3]

袖珍菇粉末→熱水浸提→多糖浸提液→去雜蛋白→乙醇沉淀→檢測多糖含量。

稱取2 g袖珍菇粉末加入一定的水倒入燒杯內(nèi)攪拌，放在恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫到試驗溫度，浸提一定的時間，提取完畢后，對提取液進(jìn)行抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾，將 Sevag（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）試劑加入到濾液中，使樣品中的蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)沉淀離心除去，然后再加入一定濃度的乙醇溶液在一定溫度下沉淀特定的時間，離心30 min，棄去上清液，得黃褐色沉淀，分別加入100 mL水復(fù)溶，得粗多糖溶液。

樣品測定：吸取2 mL樣品液于試管中，加入6%苯酚溶液1 mL，混勻，再加濃硫酸5 mL，充分混合，放置10 min，按試驗方法測定吸光度，由于分光光度計只能測顏色較淺的溶液，所以實(shí)際測量時將上面的樣品稀釋10倍，為避免誤差，吸光度多次測量求取平均值，計算多糖含量。

1.2.3.3 料液比對袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提時間1 h，溫度60℃，醇沉濃度80%，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（mg/mL）進(jìn)行比較研究，確定最佳料液比。

1.2.3.4 浸提時間對袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），溫度 60 ℃，醇沉濃度80%，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對浸提時間 1、2、3、4、5 h 進(jìn)行比較研究，確定最佳時間。

1.2.3.5 浸提溫度對袖珍菇多糖得率的影響

式中：xq為需求某點(diǎn)X軸坐標(biāo)值，m；yq為需求某點(diǎn) Y軸坐標(biāo)值，m；zq為需求某點(diǎn) Z軸高程，m；xg、xd為已知點(diǎn)X軸坐標(biāo)值，m；yg、yd為已知點(diǎn) Y軸坐標(biāo)值，m；zg、zd已知點(diǎn) Z 軸高程，m；

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時間 1 h，醇沉濃度80%，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對浸提溫度 60、70、80、90、100 ℃進(jìn)行比較研究，確定最佳溫度。

1.2.3.6 乙醇濃度對袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時間 1 h，溫度60℃，醇沉?xí)r間4 h，醇沉溫度25℃，以多糖得率為指標(biāo)，對乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行比較研究，確定最佳濃度。

1.2.3.7 醇沉溫度對袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時間 1 h，溫度60℃，醇沉?xí)r間4 h，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，對醇沉溫度4、25、40℃進(jìn)行比較研究，確定最佳溫度。

1.2.3.8 醇沉?xí)r間對袖珍菇多糖得率的影響

設(shè)定浸提料液比 1∶20（mg/mL），時間 1 h，溫度60℃，醇沉溫度25℃，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，對醇沉?xí)r間 4、6、8、10、12 h 進(jìn)行比較研究，確定最佳時間。

1.2.3.9 正交試驗

熱水浸提法條件優(yōu)化：

以料液比，浸提溫度和浸提時間為直接因素，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗。其中料液比水平為1∶20、1∶30、1∶40（mg/mL），浸提溫度水平為 70、80、90 ℃，浸提時間水平為 1、2、3 h。

乙醇沉淀多糖工藝條件優(yōu)化：

在料液比 1∶20（mg/mL），浸提溫度 60 ℃，浸提時間1 h的相同條件下得到的浸提液，選取乙醇濃度，沉淀時間和沉淀溫度為直接因素，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗，其中乙醇濃度水平為60%、70%、80%，醇沉?xí)r間水平為 4、8、12 h，醇沉溫度水平為 4、25、40℃。

2 試驗結(jié)果

2.1 加水量對秀珍菇多糖得率的影響

采用不同的加水比例，其他試驗條件完全相同，以多糖得率為指標(biāo)，以確定最佳料液比，結(jié)果見表2。

表2 料液比對袖珍菇多糖得率的影響Table 2 Mushroom polysaccharides material liquid extraction ratio effects of pocket

圖2 料液比對袖珍菇多糖得率的影響Fig.2 Material liquid extraction ratio effects of pocket mushroom polysaccharides

由圖2可知，水的不同用量對袖珍菇多糖的得率有較大影響，隨體系水含量的增加，其多糖得率呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定。隨著料液比的增加，多糖與有水接觸面的濃度差增大，多糖就越容易滲透出來，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時，袖珍菇中的多糖絕大部分已被溶解出來，結(jié)果表明，料液比在1∶40時多糖濃度達(dá)最高。結(jié)合生產(chǎn)成本，故選用料液比為 1∶20、1∶30、1∶40 進(jìn)行正交試驗。

2.2 浸提時間對秀珍菇多糖得率的影響

對于浸提時間，在設(shè)定浸提溫度60℃，料液比1∶40的條件下，以多糖得率為指標(biāo)，確定最佳浸提時間，其結(jié)果見表3。

表3 浸提時間對袖珍菇多糖得率的影響Table 3 Extraction time for pocket mushroom polysaccharides extraction

圖3 浸提時間對袖珍菇多糖得率的影響Fig.3 Extraction time for pocket mushroom polysaccharides extraction

由圖3可知，浸提時間越長，熱水對物料作用的越充分，多糖浸出的越多，袖珍菇多糖的得率增加。當(dāng)達(dá)到一定時間后，多糖得率達(dá)到最大值，然后下降，這是由于隨著時間增長，溶液體系濃度達(dá)到平衡。從圖中可以看出，浸提2 h可以對袖珍菇多糖進(jìn)行充分提取。因此，本試驗選擇1、2、3 h進(jìn)行正交試驗。

2.3 浸提溫度對秀珍菇多糖得率的影響

以浸提溫度為單一變量，其他條件完全相同，以多糖得率為指標(biāo)，確定最佳浸提溫度，其結(jié)果見表4。

表4 浸提溫度對袖珍菇多糖得率的影響Table 4 Extraction of pocket mushroom polysaccharides extraction temperature

圖4 浸提溫度對袖珍菇多糖得率的影響Fig.4 Extraction of pocket mushroom polysaccharides extraction temperature

由圖4可以看出，浸提溫度高低對袖珍菇多糖得率影響比較明顯。隨著浸提溫度的增高，多糖得率先增加，然后略有下降。這可能是由于溫度升高，空化作用和機(jī)械作用越劇烈，媒質(zhì)粒子的速度和加速度亦越大，界面擴(kuò)散層上的分子擴(kuò)散就越快，使袖珍菇中的多糖滲出速度就越快。但溫度過高，袖珍菇中其它成分吸出，導(dǎo)致多糖得率緩慢下降。所以本試驗選擇70、80、90℃進(jìn)行正交試驗。

2.4 正交試驗結(jié)果

由單因素試驗可以看出，每種單一的因素達(dá)到一定程度時，對提高多糖得率都有一定的難度，必須綜合多個因素，確定出合理的水平，才能得到理想的袖珍菇多糖提取工藝參數(shù)。因此，在各單因素初步試驗的基礎(chǔ)上，選擇了各因素的3個水平，以多糖的得率作為參考指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，確定袖珍菇多糖提取最佳工藝參數(shù)[4]，結(jié)果見表 5。

表5 不同浸提條件下的袖珍菇多糖提取效果Table 5 Under the condition of different extraction ofmushroom polysaccharides extract pocketbook

從表5可以看出，R值以料液比（0.211）最大，溫度（0.040）其次，提取時間（0.037）最小。表明料液比決定袖珍菇多糖得率的主要影響因素，其次是浸提溫度和提取時間。

從K值可以看出，料液比以 1∶40（mg/mL）處理提取效率最高，浸提時間以3 h處理提取效率最高，浸提溫度以80℃提取效率最高。將3個因素的最優(yōu)水平結(jié)合在一起得最佳浸提條件：料液比1∶40（mg/mL），時間3 h，浸提溫度80℃。

按照最佳提取條件進(jìn)行了驗證，得出的多糖得率為0.931%，高于其他條件的得率，因此認(rèn)為此工藝條件是可行的。

以上試驗采用水作為浸提液對秀珍菇多糖進(jìn)行了試驗研究。對于多糖的得率中，我們還有一個重要的因素就是醇沉條件，下面對乙醇沉淀濃度、沉淀溫度、沉淀時間進(jìn)行了研究。

2.5 乙醇濃度對袖珍菇多糖得率的影響

對乙醇濃度我們采用了50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇，在其他試驗條件完全一定的條件下，以多糖得率為指標(biāo)，確定最佳乙醇濃度，其結(jié)果見表6。

表6 乙醇濃度對袖珍菇多糖得率的影響Table 6 The concentration of ethanol extraction mushroom polysaccharides pocketbook

圖6 乙醇濃度對袖珍菇多糖得率的影響Fig.6 The concentration of ethanol extraction mushroom polysaccharides pocketbook

由圖6，乙醇濃度在50%～70%時隨著乙醇濃度的升高多糖得率也升，乙醇濃度超過70%以后隨著濃度升高多糖提取率反而下降，所以得最佳乙醇濃度70%。

2.6 醇沉溫度對袖珍菇多糖得率的影響

對乙醇溫度采用了4、25、40℃。浸提時間1 h，溫度60℃，醇沉?xí)r間4 h，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，其結(jié)果見表7。

表7 醇沉溫度對袖珍菇多糖得率的影響Table 7 Alcohol extraction temperature on the mushroom polysaccharides pocketbook

由圖7得出，醇沉?xí)r醇沉溫度在25℃范圍內(nèi)隨著溫度上升多糖得率升高，過了25℃以后，隨著溫度上升多糖得率反而下降，由此得出最佳醇沉溫度25℃。

2.7 乙醇醇沉?xí)r間對袖珍菇多糖得率的影響

對醇沉?xí)r間采用了 4、6、8、10、12 h。浸提時間 1 h，溫度60℃，醇沉溫度4℃，醇沉濃度60%，以多糖得率為指標(biāo)，其結(jié)果見表8。

圖7 醇沉溫度對袖珍菇多糖得率的影響Fig.7 Alcohol extraction temperature on the mushroom polysaccharides pocketbook

表8 醇沉?xí)r間對袖珍菇多糖得率的影響Table 8 Alcohol extraction time to a small mushroom polysaccharides

圖8 醇沉?xí)r間對袖珍菇多糖得率的影響Fig.8 Alcohol extraction time to a small mushroom polysaccharides

以圖8看，醇沉?xí)r間在8 h之內(nèi)隨著時間的增加多糖得率逐漸上升，8 h以后隨著時間增加得率反而下降，多糖得率在醇沉8 h時達(dá)到最大值，所以醇沉最佳時間8 h。

2.8 不同醇沉條件正交試驗結(jié)果

從以上單因素試驗可以看出，每種單一的因素達(dá)到一定程度時，對提高多糖濃度都有一定的難度，必須綜合多個因素，確定出合理的水平，才能得到理想的多糖醇沉的工藝參數(shù)。因此根據(jù)以上各單因素多水平的初步試驗，選擇了各因素的3個水平，以多糖得率作為參考指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，來確定袖珍菇多糖醇沉工藝參數(shù)[5]，結(jié)果見表 9。

從表9可以看出，R值以醇沉溫度（0.128）最大，醇沉?xí)r間（0.167）次之，乙醇濃度（0.069）最小。表明醇沉溫度對袖珍菇多糖的得率影響最大，乙醇濃度影響最小。

表9 不同醇沉條件的袖珍菇多糖提取效果Table 9 Different alcohol extract of pocket mushroom polysaccharides conditions

同時可以得出，醇沉溫度以4℃處理多糖含量最高，但4℃與25℃條件下醇沉?xí)r多糖的得率相差甚微，考慮到節(jié)約能源，采用25℃醇沉溫度進(jìn)行醇沉較為適宜；醇沉?xí)r間4 h處理多糖含量達(dá)到最大值；醇沉?xí)r乙醇濃度60%處理多糖得率最高。將3個因素的最優(yōu)水平結(jié)合在一起，得到優(yōu)化的醇沉條件的組合。結(jié)果確定，最佳的醇沉條件為醇沉濃度60%，醇沉?xí)r間8 h，醇沉溫度25℃。

按照最佳醇沉條件進(jìn)行了驗證，得到的多糖得率為0.775%，高于其他條件的得率，所以此工藝條件有可行性。

綜合以上兩個正交試驗的試驗結(jié)果，以料液比1∶40（mg/mL），浸提時間 3 h，浸提溫度 80 ℃，醇沉?xí)r乙醇濃度60%，醇沉?xí)r間8 h，醇沉溫度25℃為實(shí)驗條件進(jìn)行了驗證，得到的多糖得率為0.968%，高于其他條件下的多糖得率，因此這工藝條件是可行的。

3 結(jié)論

熱水浸提法相對于其它方法而言具有設(shè)備簡單，操作方便，適用面廣以及節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)本試驗在用熱水浸提法提取袖珍菇多糖的工藝中通過單因素和正交試驗得出了袖珍菇多糖的最佳提取工藝參數(shù)：料液比 1∶40（mg/mL），浸提溫度 80 ℃，浸提時間 3 h，醇沉?xí)r乙醇的濃度60%，醇沉?xí)r間8 h，醇沉溫度25℃，在此條件下多糖的得率為0.968%。

近年來，食用菌多糖[6]的研究和應(yīng)用已取得很大的進(jìn)步，但仍存在許多問題，總結(jié)起來主要有以下三個問題：第一，是食用菌多糖的構(gòu)效關(guān)系研究。有廣泛生理活性的食用菌多糖活性強(qiáng)弱與分子組成、連接方式、立體構(gòu)型、相對分子量、糖鏈的分支程度、溶解度等有密切關(guān)系。多糖官能團(tuán)的改造已成為研究多糖構(gòu)效關(guān)系的有效手段。目前人們對食用菌多糖構(gòu)效關(guān)系的研究還僅限于對其一級結(jié)構(gòu)的研究，還很不完善，須在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，加快多糖結(jié)構(gòu)研究的速度，爭取在方法上有突破，深入了解其生物活性。第二，是食用菌多糖的提取純化研究。隨著對多糖認(rèn)識的不斷加深，尋找一種有效的提取方法是迫切需要解決的問題。目前提取多糖的方法很多，每種都有其優(yōu)缺點(diǎn)。要根據(jù)提取物的性質(zhì)、提取成本、工藝設(shè)備等選擇適合的提取方法，提高多糖類的提取率，減少原材料的消耗[6]。第三，是食用菌多糖活性功能機(jī)理的研究?，F(xiàn)人們對食用菌多糖的藥理研究已有相當(dāng)一段時間，雖取得較大進(jìn)展，但創(chuàng)新研究很少。現(xiàn)在在這方面的研究多側(cè)重在利用一些免疫指標(biāo)分析其生物活性和免疫機(jī)理。

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