葵花籽粕蛋白質(zhì)提取工藝參數(shù)優(yōu)化

加列西·馬那甫，景偉文，吐力吾汗·阿米汗

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

葵花籽是資源豐富的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，葵花籽粕是油脂加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量達(dá)29%～43%，綠原酸含量達(dá)1.1%～4.5%，是未能充分利用的植物蛋白質(zhì)來(lái)源，通常作為低廉的動(dòng)物飼料使用。從葵花籽粕中提取蛋白質(zhì)時(shí)，綠原酸很容易被氧化成綠色的醌，使蛋白質(zhì)呈深褐色或棕褐色，與蛋白質(zhì)分子反應(yīng)生成非反芻動(dòng)物無(wú)法消化的非營(yíng)養(yǎng)成分，從而降低蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性質(zhì)。在20%～80%的有機(jī)溶劑中溶解度很小，因而乙醇提取綠原酸的過(guò)程中蛋白質(zhì)損失很少[1-3]。

目前葵花籽粕蛋白質(zhì)的提取工藝研究，以正交試驗(yàn)方法確定其最佳工藝條件為主，未見(jiàn)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝的報(bào)道[4-7]。雖然正交試驗(yàn)方法能夠同時(shí)考慮幾種影響因素，尋找最佳因素水平組合，卻不能找出因素與響應(yīng)值間的確切函數(shù)表達(dá)式，即回歸模型，從而無(wú)法找到全部影響因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。本實(shí)驗(yàn)以葵花籽粕為原料，采用乙醇浸提法脫除葵花籽粕中的綠原酸，鹽提法提取蛋白質(zhì)，應(yīng)用響應(yīng)面法[8-11]優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取工藝，通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立各影響因素與蛋白質(zhì)提取率的數(shù)學(xué)模型，獲得最優(yōu)的生產(chǎn)工藝參數(shù)，為葵花籽粕的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考和借鑒。

1 儀器、材料與試劑

1.1 材料與試劑

材料：葵花籽粕，新疆獸藥飼料監(jiān)察所提供。

試劑：乙醚、無(wú)水乙醇、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、對(duì)硝基酚、乙酸、乙酸鈉、甲醇、乙酰丙酮、硫酸銨均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器

TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204-IC電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；WC/09-05恒溫水浴槽：上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠；pHS-3C型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽粕蛋白質(zhì)的提取

稱取干燥，過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩的葵花籽珀粉末，脫脂，脫綠原酸（料液比1∶14、55%乙醇、60℃和pH為6的實(shí)驗(yàn)條件提取1.5 h），在40℃干燥恒重，精稱約3 g，加1.5 mol/LNaCl溶液，60℃和pH為8條件下提取1.5 h，過(guò)濾，殘?jiān)?.5 mol/L NaCl溶液洗滌數(shù)次，濾液和洗液用水稀釋至100 mL容量瓶中，即為待測(cè)葵花籽粕蛋白質(zhì)的提取液。

1.3.2 葵花籽粕蛋白質(zhì)含量與提取率的測(cè)定

含量與提取率的測(cè)定：蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用GB/T5009.5-2003（方法二）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)方法

以葵花籽粕為原料，利用鹽提法研究NaCl濃度、提取溫度和液料比對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化葵花籽粕蛋白質(zhì)的提取條件

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法，在三因素三水平上對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.1 NaCl濃度對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別用 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3 mol/L的NaCl溶液提取蛋白質(zhì)，考察不同濃度的NaCl溶液對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 NaCL濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of NaCl concentration of extraction on LBPP yield

由圖1可知，隨著NaCl濃度的增大，蛋白質(zhì)的提取率也逐漸增大。當(dāng)NaCl濃度為1.5 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率最高。當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增加時(shí)提取率開(kāi)始下降，因此NaCl濃度選擇在1.5 mol/L較為適宜。

2.1.2 提取溫度對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

在相同試驗(yàn)條件下，分別在 30、40、50、60、70 和80℃進(jìn)行提取，考察不同提取溫度對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of temperature of extraction on LBPP yield

由圖2可知，蛋白質(zhì)提取率隨著溫度的提高而增加，50℃～70℃的提取率最高，溫度再提高，提取率有下降的趨勢(shì)，在60℃以上，蛋白質(zhì)變性明顯，氮的可溶性降低。因此溫度選擇在60℃較為適宜。

2.1.3 料液比對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別用 1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶14、1∶16 和 1∶18（g/mL）的料液比進(jìn)行提取，考察不同料液比對(duì)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of water/dry ratio of extraction on LBPP yield

由圖3可知，隨著料液比的增加，蛋白質(zhì)的提取率也明顯增加。當(dāng)料液比增加到1∶12（g/mL）以后，蛋白質(zhì)提取率有下降的趨勢(shì)，因此料液比選擇在1∶12（g/mL）比較合適。

2.2 葵花籽粕蛋白質(zhì)提取工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在前面單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以NaCl濃度、提取溫度和料液比三個(gè)因素為自變量，以葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平Table 1 Testing factors and levels for Box-Behnken Designing

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of responsesurface central composite design

2.2.2 模型的建立與方差分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，利用SAS9.1.3軟件，對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得NaCl濃度、提取溫度、料液比與葵花籽粕蛋白質(zhì)提取率的二次多元回歸方程為：

Y=-49.673 75+3.327 500A+1.373 750B+6.854 375C+0.013 029AB-0.135 000AC-0.032 875BC-3.360 000A2-0.009 675B2+0.016 951C2

式中A、B、C在設(shè)計(jì)中均經(jīng)過(guò)量綱線性編碼處理，所以上式中的各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小直接體現(xiàn)出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度大小，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。

對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到的方差分析結(jié)果如表4所示。

由表3的回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表4方差分析可知，方程模型F值為99.4，P＜0.001，表明回歸模型顯著；失擬項(xiàng)F值為17.79，P=0.2030＞0.05，并且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精密度 R2=99.44%，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差是不顯著的，說(shuō)明該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況較好。同由表3可以看出，各因素中一次項(xiàng)B、C是差異極顯著，二次項(xiàng)A、B也是差異極顯著，C是極顯著，其次是交互項(xiàng)AB、BC也是極顯著的，由此可見(jiàn)，各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test for each term in the regression model

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

等高線的形狀反映了交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互影響顯著，圓形則與之相反。由圖4～6可知，提取中提取溫度與NaCl濃度之間的交互作用較小，NaCl濃度與料液比、料液比與提取溫度之間有一定的相互作用。

2.2.3 最優(yōu)葵花籽粕蛋白質(zhì)提取工藝的確定

通過(guò)軟件SAS9.1.3求解方程，得到葵花籽粕蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取工藝條件為：NaCl濃度1.51 mol/L、料液比 1∶12.88（g/mL）、提取溫度 60.27℃、對(duì)應(yīng)的理論提取率響應(yīng)值為36.64%。該回歸方程與實(shí)際情況很吻合，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化葵花籽粕蛋白質(zhì)的提取工藝是可行的。

圖4 溫度和NaCl濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effects of NaCl conection and extraction time on the yield of protein

圖5 NaCl濃度和料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effects of NaCl conection and wate/rdry ratio on the yield of protein

圖6 溫度和料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.6 Effects of extractiom time and dry/water ratio on the yield of protein

3 結(jié)論

1）與正交設(shè)計(jì)法比較，響應(yīng)面分析法在試驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中，可以連續(xù)對(duì)試驗(yàn)各水平進(jìn)行分析，同時(shí)，通過(guò)中心組合試驗(yàn)，研究幾種試驗(yàn)因素間的交互作用，求得高精密度的回歸方程，具有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作方便，精確度高等優(yōu)點(diǎn)。

2）本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化葵花籽粕蛋白質(zhì)的提取工藝，通過(guò)擬合方程得到的最佳工藝條件與模型預(yù)測(cè)值基本一致。此優(yōu)化的工藝參數(shù)可以有效減少操作中的盲目性，并為下一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

3）我國(guó)葵花籽粕資源豐富，由于葵花籽粕中綠原酸的存在，與蛋白質(zhì)分子反應(yīng)生成非反芻動(dòng)物無(wú)法消化的非營(yíng)養(yǎng)成分，從而降低了蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性質(zhì)。本文首先從葵花籽粕中提取綠原酸，然后進(jìn)一步提取優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，對(duì)葵花籽粕實(shí)現(xiàn)多次增值，具有一定的使用價(jià)值。

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