加味參附顆粒對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響*

靳利利 袁 丁 史振羽 姚 楠 王清海

（廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095）

加味參附顆粒對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響*

靳利利 袁 丁 史振羽 姚 楠 王清海

（廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095）

目的建立大鼠心衰模型，觀察加味參附顆粒對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄法造模成功的慢性心力衰竭大鼠模型的心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、血清TNF-α及IL-6的表達(dá)和超微結(jié)構(gòu)的影響。方法雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常組（不給藥）、模型組（灌胃生理鹽水）、曲美他嗪組（灌胃曲美他嗪5.4 mg/kg）、加味參附顆粒低劑量組（灌胃加味參附顆粒6.84 g/kg）、加味參附顆粒高劑量組（灌胃加味參附顆粒13.68 g/kg）各10只，采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立心衰模型。測(cè)定心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、血清TNF-α及IL-6的表達(dá)和電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)形態(tài)。結(jié)果加味參附顆粒高、低劑量均能夠顯著提高心衰大鼠心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷。結(jié)論加味參附顆粒對(duì)心衰大鼠超微結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)慢性心衰心肌各細(xì)胞因子的表達(dá)具有重要的抑制效應(yīng)，并通過(guò)調(diào)節(jié)心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性發(fā)揮作用。

心力衰竭 加味參附顆粒 超微結(jié)構(gòu)

慢性心力衰竭發(fā)病率高、死亡率高，為心血管科常見(jiàn)病和多發(fā)病，同時(shí)其發(fā)病率和患病率也在逐年增加。加味參附顆粒是本文作者之一王清海教授研制的中藥復(fù)方制劑，臨床用于防治心力衰竭，具有明顯的臨床療效。為進(jìn)一步闡明驗(yàn)方加味參附顆粒的作用機(jī)制，本課題組開(kāi)展了加味參附顆粒對(duì)心力衰竭大鼠超微結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究，并觀察對(duì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的影響以及探討加味參附顆粒治療慢心衰的部分可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2008-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)No.0100288。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)SYXK （粵）2010-0059。

1.2 藥物 加味參附顆粒由紅參、附子、茯苓、葶藶子等藥物組成（廣東省第二中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，粵藥制字Z20071343，批號(hào)20120201）使用時(shí)溶于生理鹽水中，混勻后用于動(dòng)物灌胃。曲美他嗪片 （山東瑞陽(yáng)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20066534）。每次灌胃前將藥物研磨粉碎，再用蒸餾水稀釋使用。

1.3 模型制備 隨機(jī)分組為正常組、模型組、曲美他嗪組、加味參附顆粒低劑量組、加味參附顆粒高劑量組，每組10只。除正常組外，其余大鼠用氯胺酮（50 mg/kg）和地西泮（5 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后仰臥位固定，腹部剪毛、消毒，于腹部正中切開(kāi)皮膚層，沿腹白線切開(kāi)肌肉層。用生理鹽水紗布遮蓋創(chuàng)面，然后分離膈肌下腎動(dòng)脈分支上的一小段腹主動(dòng)脈，將棉線穿至腹主動(dòng)脈下，選擇直徑1 mm軟導(dǎo)管置于腹主動(dòng)脈上，用棉線將動(dòng)脈及導(dǎo)管結(jié)扎在一起至完全阻斷血流后，抽出導(dǎo)管，結(jié)扎后的腹主動(dòng)脈內(nèi)徑即為導(dǎo)管直徑?？p合手術(shù)創(chuàng)面，消毒，腿部肌內(nèi)注射青霉素，術(shù)后注意保暖，待動(dòng)物完全清醒，送回動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 給藥方法 加味參附顆粒低劑量組每日灌服6.84 g生藥/kg（等同于臨床劑量），高劑量組每日灌服13.68 g生藥/kg（等同于2倍臨床效量），曲美他嗪組予每日灌服5.4 mg/kg，模型組給同體積的生理鹽水。正常組不給藥。給藥8周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) （1）心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的測(cè)定。組織線粒體分離試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)為C3606，碧云天生物技術(shù)研究所。根據(jù)每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmoL無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位。計(jì)算公式：組織中ATPase活力=測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（0.02 μmol/mL）×6×7.8+待測(cè)勻漿蛋白濃度。（2）ELISA法檢測(cè)血清TNF-α及IL-6的表達(dá)。麻醉后大鼠腹主動(dòng)脈取血，干凈促凝管中室溫凝固30 min后1000 r/min離心15 min，收集血清并分裝。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。（3）心肌超微結(jié)構(gòu)觀察。隨機(jī)抽取各組左心室缺血區(qū)心肌組織，做成切片，供心肌超微結(jié)構(gòu)觀察，每組1只。取各組大鼠左心室心肌組織，切成1 mm3大小，超微標(biāo)本入3％戊二醛固定液固定2 h，1％鋨酸固定1 h，逐級(jí)酒精、丙酮脫水后，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，經(jīng)鈾、鉛雙重染色后，送中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院電鏡室，1200E X透射電鏡觀測(cè)各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s）表示，采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比較 見(jiàn)表1。結(jié)果示各治療組血清TNF-α、IL-6的表達(dá)較模型組均明顯降低，而模型組與正常組，加味參附顆粒高劑量組與加味參附顆粒低劑量組、曲美他嗪組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。模型組中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均較低，而曲美他嗪組、加味參附顆粒低劑量組及加味參附顆粒高劑量組較模型組明顯升高（P＜0.05）；加味參附顆粒高劑量組與曲美他嗪組相近（P＞0.05）。

表1 各組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比較（分，±s）

表1 各組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與正常對(duì)照組相比，△P＜0.05；與加味參附顆粒高劑量組比較，▲P＜0.05。

組 別 n Na+-K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）正常組 10 3.15±0.75* 1.76±0.39* 53.96±3.18* 352.40±87.20*模型組 10 2.23±0.48 0.66±0.63 420.36±67.57△3704.44±1048.81△曲美他嗪組 10 3.35±0.58* 1.13±0.56*105.86±4.03* 672.92±143.94*加味參附顆粒低劑量組 10 3.01±0.53*▲ 0.96±0.50*▲180.48±44.84*▲1783.60±130.04*▲加味參附顆粒高劑量組 10 3.30±0.63 1.12±0.498 108.64±0.50* 996.52±40.65*

2.2 各組心肌透射電鏡觀察結(jié)構(gòu)情況 正常組：肌原纖維縱向走向，肌節(jié)結(jié)構(gòu)明顯，肌絲排列整齊，明暗帶結(jié)構(gòu)清楚，其間可見(jiàn)線粒體及肌漿網(wǎng)，線粒體排列較整齊，結(jié)構(gòu)清楚，線粒體間可見(jiàn)少量脂滴，細(xì)胞核核膜清楚，可見(jiàn)核孔，無(wú)聚集成塊、無(wú)空泡形成等現(xiàn)象。模型組：心肌肌原纖維排列較紊亂，肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊，明暗帶結(jié)構(gòu)不清，心肌收縮帶形成，線粒體增生，體積增大，壓迫肌原纖維，線粒體形狀大小不一，排列尚整齊，結(jié)構(gòu)不清，部分溶解、斷裂、核膜部分溶解、消失，邊緣不規(guī)則，部分線粒體空泡形成等。曲美他嗪組：心肌肌原纖維排列較整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)較明顯，明暗帶較清楚，線粒體大多排列較整齊，結(jié)構(gòu)較清楚，包膜完成，未見(jiàn)明顯腫脹，未見(jiàn)溶解與斷裂，線粒體間可見(jiàn)少量脂滴，細(xì)胞核核膜部分不清楚。加味參附顆粒組高、低劑量組：肌原纖維排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)明顯，肌絲排列整齊，明暗帶清楚，其間可見(jiàn)線粒體及肌漿網(wǎng)，線粒體排列較整齊，結(jié)構(gòu)清楚，嵴結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)腫脹，線粒體間可見(jiàn)少量脂滴，細(xì)胞核核膜較清楚，包膜完整，無(wú)結(jié)塊及邊集現(xiàn)象，無(wú)空泡形成，兩圖比較差異性不大。

3 討論

Na+-K+-ATP酶（鈉泵）和Ca2+-ATP酶是廣泛存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器膜上的一種蛋白酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Na+-K+梯度［1］，心室肌、心房肌和蒲肯耶纖維的這種跨膜梯度是形成動(dòng)作電位去極相Na+內(nèi)流和K+外流的動(dòng)力，是形成細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度是心肌維持正常生理功能的重要因素，心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶受到抑制時(shí)，必然導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+升高，K+降低，Na+-Ca2+交換減少造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高，進(jìn)而影響心肌的收縮力。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力的高低是細(xì)胞能量代謝及功能有無(wú)損傷的重要指標(biāo)。

圖1 心肌透射電鏡圖（×18500）

炎癥細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)于心衰的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，可降低心肌收縮力及心輸出量，促進(jìn)自發(fā)性功能障礙、胰島素抵抗、內(nèi)皮損失及血液高凝狀態(tài)等［2］。血清IL-6、TNF-α的水平與心血管危險(xiǎn)因素患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)［3］，可能通過(guò)下調(diào)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶，推遲舒張心肌細(xì)胞鈣離子的再吸收和衰減，導(dǎo)致心臟舒張功能不全［4］。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均較低，而曲美他嗪組、加味參附顆粒低劑量組及加味參附顆粒高劑量組較模型組明顯升高，加味參附顆粒與模型組差異顯著，說(shuō)明益氣溫陽(yáng)、活血利水的加味參附顆粒治療效果明顯。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明加味參附顆粒并降低血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，說(shuō)明益氣溫陽(yáng)、活血通絡(luò)中藥復(fù)方制劑有效成分配伍對(duì)上述細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)有一定的抑制作用，且療效優(yōu)于單一用藥組，與曲美他嗪功效相近。

同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)加味參附顆粒干預(yù)后的心衰大鼠的心肌纖維、線粒體等組織受到的破壞明顯減少，肌原纖維排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)明顯，肌絲排列整齊，明暗帶清楚，其間可見(jiàn)線粒體及肌漿網(wǎng)，線粒體排列較整齊，結(jié)構(gòu)清楚，嵴結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)腫脹，線粒體間可見(jiàn)少量脂滴，細(xì)胞核核膜較清楚，包膜完整，無(wú)結(jié)塊及邊集現(xiàn)象，無(wú)空泡形成，說(shuō)明加味參附顆粒在改善心肌超微結(jié)構(gòu)方面優(yōu)勢(shì)亦較明顯。

既往的研究也表明，加味參附顆粒不僅改善慢性心衰患者的臨床癥狀，降低體循環(huán)外周阻力，減輕左心后負(fù)荷，增強(qiáng)心肌收縮力、提高心輸出量有明顯的功效，而且通過(guò)6 min步行實(shí)驗(yàn)的辦法評(píng)價(jià)出改善患者心功能，改善預(yù)后，提高生活質(zhì)量等方面亦療效明顯［5-7］。

本實(shí)驗(yàn)選擇以心肌線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性為觀察指標(biāo)，通過(guò)電鏡觀察加味參附顆粒對(duì)心衰大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果提示模型大鼠的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明顯下降，存在能量代謝異常，而經(jīng)加味參附顆粒干預(yù)的心衰大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性未見(jiàn)下降，并有一定程度的升高，提示加味參附顆?？赡芡ㄟ^(guò)提高心衰大鼠的心肌ATP酶來(lái)改善心衰大鼠的心肌能量代謝，進(jìn)而對(duì)心肌的超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，這可能是加味參附顆粒治療心衰的作用機(jī)制。故從陽(yáng)虛血瘀水停-心肌超微結(jié)構(gòu)角度探討加味參附顆粒對(duì)心衰治療的干預(yù)效應(yīng)，開(kāi)發(fā)中藥有效成分配伍組成的新藥，有望成為心衰治療學(xué)研究的重要途徑。

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Ef fect of Jiaweishenfu Granule on Ultrastructure of M yocardium in Rats with Chronic Heart Failure

JIN Li-li，YUAN Ding，SHI Zhen-yu，et al. The Second TCM Hospital of Guangdong Province，Guangdong，Guangzhou 510095，China

Objective：To establish heart failure model of rats with chronic heart failure by abdominal aorta constriction and to observe the effect of Jiaweishenfu granule on myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme，activity of Ca2+-ATP enzyme，serum TNF-α and IL-6 expression，and ultrastructure.M ethods：50 male SD rats were randomly divided into normal control group，model group，Qumei trimetazidine group，low dose of Jiaweishenfu granule group，and high dose of Jiaweishenfu granule group，10 rats in each group.Rats with heart failure model were established by abdominal aortic coarctation method.Myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-ATP enzyme activity，and expressions of serum TNF-α and IL-6 were determined.Ultrastructure under electron microscopic was observed.Results：low dose of Jiaweishenfu granule group can significantly improve activity of myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme，and reduce myocardial ultrastructure damage.Conclusion：Jiaweishenfu granule has a protective effect on ultrastructure of heart failure rats.It works by inhibiting expression of chronic heart failure cytokines，and by regulating activity of myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme.

Heart failure；Jiaweishenfu granule；Ultrastructure

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0602-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.016

廣東省科技計(jì)劃課題（2010B030700021）

2013-12-19）