γ-氨基丁酸純化的研究

（烏魯木齊思科康達(dá)科技有限責(zé)任公司，烏魯木齊市，830000） 武建剛

γ-氨基丁酸（GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理功能。目前，已有大量關(guān)于GABA生物合成方面的研究，但是關(guān)于GABA分離方面的研究報道卻不多，就γ-氨基丁酸純化進(jìn)行研究，主要是γ-氨基丁酸分離、提取及與酶反應(yīng)偶聯(lián)體系建立進(jìn)行研究。

1 強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂離子交換條件的研究

1.1 樹脂的預(yù)處理

用離子交換柱為內(nèi)徑18mm，高400mm的柱子，柱子上下帶有封口，可以用恒流泵進(jìn)行流速控制。

反洗：

取50mL樹脂，置于交換柱中，用去離子水進(jìn)行反洗，樹脂的展開率為50-100%，直到樹脂中無可見機(jī)械雜質(zhì)并出水澄清為止。

酸堿處理：

經(jīng)反洗后的樹脂依次用50mL1mol/LHCl，100 mL去離子水，50mL1mol/LNaOH和100mL去離子水，自上而下通過樹脂層。試劑流量為2mL/min，去離子水流量為10mL/min。

基準(zhǔn)型（Na型）樹脂的制備：

經(jīng)酸堿處理的樹脂用400mL1mol/LNaCl溶液通過樹脂層，流速為14mL/min。然后用去離子水洗滌，直至用硝酸銀指示液檢測出液無白色沉淀時停止洗滌。將柱中樹脂全部轉(zhuǎn)入清潔的廣口瓶中。

H型樹脂的制備：

經(jīng)酸堿處理的樹脂用400mL1mol/LHCl溶液通過樹脂層，流量為6mL/min。然后用去離子水洗滌，直至用甲基橙指示液檢驗(yàn)流出液呈黃色時停止洗滌。將柱中樹脂全部轉(zhuǎn)入清潔的廣口瓶里待用。

1.2 過柱液組分預(yù)處理和裝柱樹脂體積的預(yù)估

以每100mL醋酸-醋酸鹽緩沖液（pH5.0,0.2 mol/L）計，含MSG1g，固定化酶15g，在1.5h內(nèi)可完全反應(yīng)（紙層析檢測不到MSG的斑點(diǎn)）。反應(yīng)液中共含GABA5.34mmol（大部分以一價陽離子形態(tài)存在），主要的陽離子Na+14mmol，其他微量陽性離子忽略不計，反應(yīng)液pH在5.5左右，此外溶液中還會存在破碎的海藻酸鈉等可見微粒。按理論值每升樹脂可以交換GABA2mol，交換反應(yīng)中生成的GABA需要樹脂2.67mL，考慮到Na+的競爭吸附，則需要樹脂9.67mL，在本柱中體積約為3.8cm，反應(yīng)液若以1mL/min的流速流速通過柱子，流程約0.4cm/min，此外考慮到離子交換過程中離子交換區(qū)所占的體積，為保證GABA能被充分交換，裝填的樹脂體積定為20mL，在柱中體積為7.9cm。

1.3 樹脂離子類型的選擇

Na型和H型預(yù)處理好的樹脂各取20mL，分別裝入離子交換柱，將配制好的100mL過柱液分別以1mL/min的流速通過樹脂層，收集流出液，檢測流出液中GABA含量，確定GABA是否被完全交換及最終選擇的樹脂離子類型。

1.4 過柱液流速的選擇

將配制好的100mL過柱液以1mL/min的流速通過樹脂層，收集流出液，檢測流出液中GABA含量，確定GABA是否被完全交換。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，但過柱液分別以2、3mL/min的流速通過樹脂層，檢測流出液中GABA含量，確定過柱液流速。

1.5 最大交換量的確定

將配制好的240mL過柱液以確定的最佳流速通過樹脂層，每收集30mL過柱液，測定其中GABA含量一次，并確定最大交換容量。

2 GABA的濃縮和結(jié)晶

2.1 洗脫液濃度的選擇

過柱液通過樹脂層后，用40mL2mol/L的氨水以1 mL/min的速度進(jìn)行洗脫操作，收集洗脫液，測定其中GABA含量。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，但洗脫劑的濃度分別為1.6mol/L和1.4mol/L。

2.2 流速的選擇

過柱液通過樹脂層后，用最適的氨水濃度以1mL/min的速度進(jìn)行洗脫操作，收集洗脫液，測定其中GABA含量。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，但洗脫劑的流速分別為2ml/min和3m l/min。

2.3 柱再生

進(jìn)行洗脫操作后，用去離子水以10ml/min流速進(jìn)行反洗至中性后，用1mol/LHCl洗至酸性后，用去離子水以10mL/min流速進(jìn)行正洗至中性后即可。

2.4 濃縮和結(jié)晶

將洗脫液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在真空度0.085mpa、55～65℃下濃縮，至體積為原來體積的1/10左右（每100mL洗脫液濃縮至8～10mL），加入3～4倍體積的無水乙醇，攪拌、真空抽濾即得GABA體，將其收集并干燥為GABA成品。

3 酶柱反應(yīng)及與分離偶聯(lián)

3.1 反應(yīng)柱

為控制流速和保證反應(yīng)充分進(jìn)行，采用從柱子下端泵進(jìn)反應(yīng)液的模式。所采用的柱子上下封口，內(nèi)徑為16mm，長度為20mm。柱子過長，會引起柱壓高，不便于反應(yīng)液從底端泵入以及對固定化的酶造成壓力，迫使起破碎；柱子過短，固定化酶溶脹受阻，反應(yīng)不能充分進(jìn)行，也不利于反應(yīng)生成的CO2由液體體系內(nèi)上升并溢出。此外，柱子豎直置于37℃水浴中保溫，反應(yīng)液于37℃水浴保溫后泵入。

3.2 反應(yīng)液流速的控制

將100mL含1%MSG的醋酸-醋酸鹽緩沖液（pH5.0,0.2mol/L）由下經(jīng)電腦恒流泵以1mL/min的速度泵入反應(yīng)柱中，收集流出的反應(yīng)液測定其中GABA含量。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，但反應(yīng)液的速度分別為1.5mL/min和2mL/min，確定最佳的反應(yīng)液流速。

3.3 最大反應(yīng)量

將200mL含1%MSG的醋酸-醋酸鹽緩沖液（pH5.0,0.2mol/L）由下經(jīng)電腦恒流泵以最佳的流速泵入反應(yīng)柱中，每50mL收集一次流出的反應(yīng)液并測定其中GABA含量，確定酶活損失情況及最大的反應(yīng)量。

3.4 反應(yīng)柱與交換柱相偶聯(lián)

將反應(yīng)柱與交換柱相聯(lián)，如下圖1所示。

圖1 反應(yīng)與分離裝置的連接

取200mL反應(yīng)液，如圖1-1依次通過反應(yīng)柱和離子交換柱后，對離子交換柱進(jìn)行氨水洗脫，并對洗脫液真空濃縮收集GABA晶體。

表1 最大反應(yīng)量的確定

3.5 最大反應(yīng)量

酶珠狀態(tài)及溶液狀態(tài) 酶珠較致密,30mL時溶液中可見氣泡產(chǎn)生酶珠膨脹明顯,溶液中可見大量氣泡向上升騰酶珠繼續(xù)膨脹,個別酶珠破碎,氣泡產(chǎn)生明顯,量大10%的酶珠破碎,酶珠很軟。

表1說明固定化酶在柱反應(yīng)器中可以很好地反應(yīng)，但主要的問題在于，柱反應(yīng)器排氣不暢，柱壓過大，原因有三方面：⑴柱反應(yīng)器液面較罐式反應(yīng)器要高，酶珠單位面積所受壓力大；⑵酶珠在膨脹過程中相互擠壓和受到柱內(nèi)壁的擠壓；⑶溶液中的CO2在向上升騰的過程中所造成的壓力。

因此，有必要針對此類產(chǎn)氣的固定化酶反應(yīng)設(shè)計相關(guān)的柱。

3.6 反應(yīng)柱與離子交換樹脂相偶聯(lián)

共獲得干燥的GABA晶體0.961g，是理論值的87.2%。主要的原因在于受傳質(zhì)限制，酶反應(yīng)沒有完全進(jìn)行，此外反應(yīng)柱、離子交換柱中的殘留反應(yīng)液、洗脫液中的GABA，也是主要的損失來源。

4 總結(jié)

用于離子交換的樹脂為H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，過柱液的流速為3mL/min,采用2mol/L的氨水1mL/min的流速可以有效地將樹脂上的GABA洗脫下來，對洗脫液進(jìn)行真空濃縮并加入適量的95%乙醇后可獲得GABA結(jié)晶。柱反應(yīng)體系的最佳流速為1mL/mim，存在的主要問題在于柱壓過大導(dǎo)致的酶珠易碎。柱反應(yīng)與產(chǎn)物分離可以很好的偶聯(lián)，能夠達(dá)到邊催化反應(yīng)邊分離產(chǎn)物的目的。